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自体骨骼肌卫星细胞注射治疗女性压力性尿失禁的实验研究

李映川  
【摘要】:自体骨骼肌卫星细胞注射治疗女性压力性尿失禁的实验研究 第一部分 大鼠骨骼肌卫星细胞的原代分离、纯化及成肌特性的观察 研究目的:建立大鼠骨骼肌卫星的原代分离、纯化方法,观察大鼠骨骼肌卫星细胞的体外增殖、成肌特性。 研究方法:(1)采用胶原酶、胰蛋白酶改良两步酶消化法,分离获取大鼠骨骼肌组织中的单个核细胞,利用不同细胞群贴壁能力的差异,通过差速贴壁法去除成纤维细胞等杂质细胞,使骨骼肌卫星细胞得以纯化。(2)倒置相差显微镜观察体外培养时细胞的增殖情况和形态的变化。(3)免疫组化鉴定所分离的骨骼肌卫星细胞肌性标志desmin。(4)倒置相差显微镜下观察不同处理条件下原代分离的骨骼肌卫星细胞的成肌特性。 研究结果:(1)改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,可以分离得到较高纯度的大鼠骨骼肌卫星细胞,Desmin免疫组化鉴定纯度在85%以上。(2)骨骼肌卫星细胞贴壁速度慢,培养皿需要用多聚赖氨酸处理,细胞接种24小时后大多数骨骼肌卫星细胞完成贴壁。细胞形态呈梭形,与成纤维细胞形态相似,属纤维细胞型。(4)成肌特性观察:当细胞密度较大(生长汇合至60%~70%)或降低培养基血清浓度(含2%胎牛血清和2%马血清的DMEM培养基),细胞之间开始相互融合形成肌管细胞。所形成的肌管细胞具有多细胞核特征,肌管细胞之间也可以相互融合,外观形态上更加粗大,最终可连接成网状。在培养条件良好时有时可以观察到肌管细胞的自发收缩。 研究结论:改良两步酶消化法结合差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度骨骼肌卫星细胞的方法。骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有自发收缩特性的多细胞核肌管细胞。 第二部分 IGF-1刺激骨骼肌卫星细胞增殖及其相关机理的研究 研究目的:IGF-1对大鼠骨骼肌卫星细胞的增殖刺激效应。探讨IGF-1刺激骨骼肌卫星细胞增殖的机理。 研究方法:(1)IGF-1对骨骼肌卫星细胞的增殖刺激效应。IGF-1分为2ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml共四组,并设置空白对照组(不加IGF-1)。培养24、48小时,MTT法观察不同浓度的IGF-1在不同时间点对骨骼肌卫星细胞的增殖刺激效应。(2)western-blotting检测IGF-1刺激骨骼肌卫星细胞后PI3K信号通路效应分子的改变。取原代分离后传第二代骨骼肌卫星细胞接种于10cm培养皿,DMEM增殖培养基培养细胞增殖到30%~40%汇合后实验。分三组:空白对照组(5%FBS),IGF-1组(5%FBS+20ng/ml IGF-1),IGF-1+LY294002组(5%FBS+20ng/mlIGF-1+20uM LY294002)。无血清培养基同步化处理16小时后,加入相应的干预因素,其中LY294002组在更换培养基前用LY294002(20uM)预处理1小时。干预因素处理2小时后,抽提蛋白,western-blotting测定FOXO1、磷酸化FOXO1以及P27Kip1蛋白水平表达的改变。共收集5份标本实验。(3)RT-PCR同时检测P27~(Kip1) mRNA表达的改变。 研究结果:(1)2ng/ml IGF-1对骨骼肌卫星细胞有轻微的增殖刺激效应。从20ng/ml浓度开始,IGF-1能明显刺激骨骼肌卫星细胞的快速增殖,更高浓度的IGF-1(50ng/ml,100ng/ml)与20ng/ml的增殖刺激效应相比无显著差异。(2)IGF-1刺激后骨骼肌卫星细胞增殖迅速,容易因为细胞密度过大融合形成缺乏增殖能力的多细胞核肌管细胞。因此,利用IGF-1体外扩增骨骼肌卫星细胞时应密切观察细胞的增殖情况,及时传代和更换培养基。(3)IGF-1作用于骨骼肌卫星细胞后,PI3K信号通路效应分子FOXO1蛋白磷酸化水平增加,磷酸化、非磷酸化FOXO1比值增加。细胞周期负性调节因子P27~(Kip1)蛋白出现下调,且P27~(Kip1)mRNA的表达也出现明显的下调。 研究结论:(1)20ng/ml浓度的IGF-1足以刺激骨骼肌卫星细胞的体外快速、大量增殖。可以在短期内利用数量有限的组织快速获取大量骨骼肌卫星细胞为组织工程技术治疗相关疾病服务。(2)在利用IGF-1体外扩增骨骼肌卫星细胞时应密切观察细胞增殖状况,避免细胞融合。(3)IGF-1可以通过PI3K细胞信号通路 发挥对骨骼肌卫星细胞的增殖刺激效应。在IGF-1诱导下,磷酸化FOXO1蛋白的增加和功能失活,使细胞周期负性调节因子P27~(Kip1)在转录水平出现下调,进入细胞周期增殖的障碍被解除,促使了骨骼肌卫星细胞的活跃增殖。 第三部分 自体骨骼肌卫星细胞注射治疗女性压力性尿失禁的实验研究 研究目的:(1)利用大鼠构建用于实验研究的女性压力性尿失禁动物模型。(2)观察骨骼肌卫星细胞尿道周围注射后对尿流动力学指标产生的影响及自体骨骼肌卫星细胞尿道周围注射后局部组织形态学的改变。 研究方法:(1)实验分组及女性压力性尿失禁动物模型的建立:实验动物采用雌性SD大鼠。设正常对照组(n=10);同时建立压力性尿失禁动物模型20只,其中一部分作为压力性尿失禁动物模型组对照(n=10);一部分在造模后第2个月末接受自体骨骼肌卫星细胞尿道周围注射治疗,即细胞注射治疗组(n=10)。动物模型建立采用双侧卵巢切除+反复阴道扩张法。(2)压力性尿失禁动物模型建立后第2个月末,从大鼠后肢肌肉组织分离自体骨骼肌卫星细胞,经IGF-1体外扩增达到足够数量后,被注射到尿道周围,注射位点在近段尿道后外侧,使用Hamilton微量注射针,每侧注射细胞量为2×10~6个。(3)尿液控制机能评价:尿流动力学仪测定腹压漏尿点压。细胞注射治疗组接受细胞注射治疗1个月后,即本实验开始3个月后,3组实验动物均测定腹压漏尿点压,同时切取局部尿道组织,HE染色,观察形态学变化。 研究结果:(1)女性压力性尿失禁动物模型组腹压漏尿点压明显低于正常对照组和细胞注射治疗组。One-Way ANOVA统计分析,组间两两比较差异均有统计学意义。(2)骨骼肌卫星细胞注射1个月后,细胞注射治疗组腹压漏尿点压明显高于压力性尿失禁动物模型组,但低于正常对照组。One-Way ANOVA统计分析差异均有统计学意义。(3)自体骨骼肌卫星细胞注射后可以使注射局部尿道壁肌层增厚、肌纤维得到增强。 研究结论:(1)大鼠双侧卵巢切除+反复阴道扩张是建立女性压力性尿失禁动物模型的较为可靠的方法。(2)骨骼肌卫星细胞注射后能明显提高压力性尿失禁动 物模型的漏尿点压,对治疗压力性尿失禁有一定的疗效。注射后产生的充填效应可能是腹压漏尿点压改善的原因之一。实验观察到注射位点肌纤维得到明显的增强,因此,尿流动力学指标的改善还可能与尿道壁收缩力增强相关,但有待进一步实验证实。(3)理想的注射细胞数量和注射后对膀胱功能的远期影响还需要作进一步的研究。


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