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《复旦大学》 2006年
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古细菌视紫红质蛋白的质子泵机理及其与聚合物复合功能材料的研究

明明  
【摘要】: 二十一世纪是学科交叉的世纪,是生物、信息和材料等领域相互交融的世纪。本论文研究两种膜蛋白——细菌视紫红质(BR)和古紫质4(AR4)质子泵机理的区别和联系,运用基因工程点突变的技术对两种膜蛋白进行改性,深入考察氨基酸序列和脂环境对它们质子泵功能及光循环性质的影响,并将这种具有生物活性的生命物质和具有良好加工性能的聚合物材料相结合制备成为功能复合材料。本课题涉及了高分子材料科学、生命科学以及信息科学领域。 膜蛋白具有十分重要的生物功能,生命的基本单位——细胞与外界环境的能量转换、信息识别与传递、物质运送等基本生命过程主要通过其生物膜上的膜蛋白来完成。在过去的三十年里面,很少有单个的生物体能够像BR膜蛋白这样引起人们如此广泛的兴趣。人们相信这个简单的含有视黄醛的质子泵能够帮助我们开启离子泵机理奥秘之门,也看到了这种神奇的蛋白在应用上的巨大潜力。AR4蛋白是从在我国西藏盐湖中发现的一种嗜盐菌株中提取的含有视黄醛的膜蛋白,它与BR蛋白一样具有光驱质子泵功能。但与BR相比,AR4结构与功能的神秘面纱还未为世人所揭开,还需要我们进行不断地探索研究。 BR蛋白是最早有技术应用的光至变色的生物分子之一,而BR/聚合物功能复合材料的制备是决定其应用前景的最为关键的技术之一。如何将AR4蛋白也应用于高级防伪和光信息存储与处理领域也是一个挑战性课题。 基于此,本论文的主要创造性工作和成果为: (一)研究了AR4蛋白的光循环性质和质子泵机理,提出弱偶联模型解释AR4的特殊现象。在与BR相比较的基础上,考察了AR4质子泵功能和光循环性质的pH依赖性,测定了其几个关键氨基酸在光循环中各个状态的pK_a值,发现在高pH区域,AR4蛋白光循环中的质子提取与释放顺序发生反向,从而与BR蛋白在中性pH环境中的顺序一致。指出AR4光循环中,Asp85质子化与蛋白质子释放之间的弱偶联效应是导致AR4与BR蛋白光循环中相反的质子提取和释放顺序的原因。同时,还发现AR4中质子释放基团并没有失去功能,而是在催化质子受体Asp85的去质子化、加速AR4光循环最后过程中质子在质子释放通道内部的传递和AR4初态的回复上发挥了重要的作用。与BR相比,AR4是一个碱化了的质子泵。 (二)研究了去垢剂Triton X-100对AR4蛋白质子泵功能的影响,发现蛋白质的自组装聚集状态对于AR4的质子泵功能有重要影响。发现Triton X-100可以改变AR4蛋白光循环中的质子提取与释放的顺序,AR4聚集体与AR4单体具有截然相反的质子提取与释放顺序。并且,用Biobeads去除体系的Trion X-100后,AR4蛋白的这种质子提取与释放顺序还可以得到恢复。表明脂与蛋白的相互作用及蛋白质的聚集状态在影响AR4中的Asp85质子化与质子释放之间的偶联作用,以及调节其光循环中质子泵次序方面起到了重要的作用。 (三)研究了转基因AR4蛋白与野生AR4及BR蛋白质子泵功能的差异。通过合作研究,将AR4和BR基因在一株本身不合成菌紫质和玉红素的嗜盐菌株L33中克隆和表达,本论文发现:在L33中表达的AR4蛋白(称为转基因AR4蛋白)表现出与野生AR4蛋白以及BR蛋白都不相同的光循环和质子泵性质,其Asp85质子化与质子释放之间的偶联作用以及其他很多性质都介于野生AR4和BR之间。转基因AR4与BR蛋白具有相同的脂环境,其性质的差异由其不同的氨基酸序列所导致;而转基因AR4与野生AR4蛋白具有相同的氨基酸序列,其性质的差异归咎于其所不同的脂环境(转基因AR4的紫膜环境和野生AR4的紫红膜环境)。因此,我们提出AR4蛋白中一些特殊的氨基酸残基和其特殊的脂环境共同决定了其在光循环中与BR相反的质子提取与释放顺序。 (四)研究了两种新型BR蛋白和AR4蛋白突变体,BR-D96V和AR4-D212G的质子泵功能和光循环性质,同时将野生BR、D96N BR和野生AR4蛋白作为它们性质研究的对照。将酸性氨基酸Asp96(D96)突变成了一个非常疏水的氨基酸Val(V),并没有影响到BR蛋白基本的折叠结构,D96V BR同样具有质子泵功能,并且其光适应向暗适应的转变行为与野生BR相似。中性pH值条件下,D96V突变的BR蛋白光循环中M产物的寿命和野生BR相比有了一个数量级以上的延长,与D96N BR的M产物寿命接近。提高体系的pH值可以使D96V BR光循环中M产物寿命有着更加显著的延长。结果表明,该位点的基因突变修饰优化了BR蛋白作为光信息存储和处理材料的性能。AR4蛋白的D212G突变则改变了其光循环中的质子提取与释放顺序,从而使其与BR中的顺序一致,表明Asp212(D212)对AR4蛋白质子泵的次序有着至关重要的作用。 (五)初步考察了重组的上述蛋白质与聚合物复合体系以及潜在的光信息材料。通过基因工程改性成功地使AR4蛋白具备了一定的潜在应用价值,并在聚合物和BR蛋白的改性以增强它们之间的相互作用、制备光学尺度均匀的复合材料上作出了探索。与BR相比,AR4中的玉红素掩盖了其吸收峰,削弱了其光致色变的反差,从而阻碍了其在光信息存储方面的可能应用。通过基因工程的方法成功去除了玉红素,并采用定点突变的方法优化其功能,将其包埋于聚合物中制成复合膜,采用简易的方法实现了其可视化的图像存储,使AR4蛋白也同样可以应用于信息存储和信息处理领域。在复合材料的制备研究中,使用两亲性的温度敏感水凝胶材料复合成膜或者凝胶,增强了蛋白与聚合物的相互作用,对制备分子尺度上均匀的BR光学材料进行了尝试。 总之,本论文立足于材料、生物、信息交叉领域的研究与探索,在基础理论研究方向上,描绘了AR4蛋白质子泵机理的图像,加深和拓展了人们对膜蛋白离子泵机理的理解,丰富了人类知识的宝库;在应用开发方向上,无论在新的AR4材料方面还是新的聚合物复合制备技术方面都进行了探索,获得了自主的知识产权。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q789

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