收藏本站
《复旦大学》 2006年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

NOD蛋白在烟曲霉感染小鼠肺组织中的表达及对烟曲霉孢子的识别机制

张辉军  
【摘要】: 烟曲霉(Af)是目前最常见的空气传播的真菌感染病原体,可导致免疫受损患者发生严重且往往是致死性的侵袭性肺曲霉病(IPA)。随着免疫受损患者的增多,IPA发病率显著增加,已成为目前免疫受损患者最常见的肺部感染性疾病之一。在过去的十余年中,尽管不断有新的抗真菌药物问世,但由于IPA早期诊断困难且病情进展迅速,其病死率仍居高不下。故开展机体抵御烟曲霉感染的免疫反应机制研究,探索预防和治疗烟曲霉感染的新措施,对于降低IPA发病率和病死率具有十分重要的意义。 先天性免疫系统是机体识别、抵御病原体感染的第一道防线,它通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)来迅速识别病原体。目前研究最多的PRRs为Toll样受体(toll-like receptors,TLRs),已被证实与抗烟曲霉感染免疫反应有关。另一类PRRs是近年来才发现的核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide- binding oligomerization domain,NOD)蛋白。NOD蛋白为胞浆内蛋白,目前认为它们与识别细胞内病原体有关。已知的NOD蛋白家族成员有20余种,其中最为重要的是NOD1和NOD2。NOD1又称CARD(caspase recruitment domain)-4蛋白,在全身各种组织细胞中都有分布,识别主要存在于革兰阴性菌中的肽聚糖(PGN)的降解产物GM-triDAP。NOD2又称CARD15,分布主要局限于上皮细胞和抗原呈递细胞(APCs),识别的最小基序为胞壁酰二肽(MDP)。MDP同时存在于革兰阴性和阳性细菌胞壁PGN的降解产物中。尽管NOD1和NOD2识别的配体不同,但它们都是通过受体相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2,RIP2)来激活NF-κB信号通路,促进一系列细胞因子的合成。已经证实NOD蛋白与多种细菌感染免疫反应有关。 烟曲霉孢子通过空气传播,由于其体积小,可顺利进入下呼吸道,当条件适宜生长时便出芽形成菌丝,侵袭组织细胞,造成组织损伤。肺上皮细胞及肺泡巨噬细胞作为肺部先天性免疫的主要组成细胞,能够吞噬、杀灭烟曲霉孢子,释放出一系列炎症细胞因子,在抵御烟曲霉感染中发挥重要作用。已有研究表明PRRs在先天性免疫系统占有重要地位,但迄今为止NOD蛋白在肺组织中的表达仅有少量研究报道,尚未见NOD蛋白在抗烟曲霉感染免疫反应中作用的研究报道。鉴于烟曲霉系胞内感染病原体,我们假设NOD蛋白可能为烟曲霉的胞浆内PRRs。本研究通过建立烟曲霉肺部感染小鼠模型及A549、THP1细胞的培养来研究肺组织中NOD相关蛋白的表达及对烟曲霉孢子的识别机制。 第一部分NOD相关蛋白在烟曲霉感染小鼠肺组织中的表达 目的:观察NOD相关蛋白在烟曲霉感染小鼠肺部组织中的表达。方法:60只雄性BALB/c小鼠随机分成2组,每组30只。通过经鼻滴入烟曲霉孢子的方法建立烟曲霉肺部感染小鼠模型,对照组小鼠经鼻滴入等量的生理盐水。分别在感染前(0h)、感染后6h、12h、24h、48h观察肺部烟曲霉负荷及病理学改变。采用RT-PCR方法检测各时间点的NOD1、NOD2及RIP2 mRNA在肺组织中的表达。采用免疫组化的方法检测各时间点两组小鼠肺组织NOD2蛋白的表达。结果:(1)感染组小鼠肺部烟曲霉负荷24h达最高峰,48h迅速下降。(2)两组小鼠肺组织均表现为支气管肺泡炎症为主的病理改变。感染组小鼠24h炎症反应最显著,48h减轻。对照组小鼠病理损害明显轻于感染组。(3)接种烟曲霉前(0h)、后6h、12h、24h、48h NOD1 mRNA表达量分别为0.34±0.05、0.41±0.08、0.46±0.07、0.47±0.04、0.47±0.48;NOD2 mRNA表达量分别为0.30±0.03、0.36±0.06、0.45±0.10、0.60±0.06、0.73±0.08;RIP2 mRNA表达量分别为0.44±0.10、0.56±0.09、0.62±0.07、0.64±0.07、0.63±0.06。感染后12h、24h、48h NOD1、NOD2、RIP2 mRNA表达上调,同感染前(0h)相比有显著差异(P<0.05)。NOD2 mRNA的表达上调比NOD1更加明显。对照组各时间点NOD1、NOD2、RIP2 mRNA表达无显著差异。感染组和对照组比较除0h、6h外各时间点NOD1、RIP2 mRNA表达均有显著差异(P<0.05)。除0h外两组各时间点NOD2 mRNA表达有显著差异(P<0.05)。(4)NOD2蛋白表达主要分布在肺泡上皮细胞。感染组小鼠肺组织0h、12h、24h、48h时NOD2蛋白免疫组化阳性指数分别为117582.7±20189.58、163854.4±17185.61、341363.9±35102.07、289114.5±38424.35,24h NOD2蛋白表达同0h相比差异有统计学意义(P<0.05)。对照组各时间点NOD2蛋白表达无显著差异。感染组、对照组组间比较24h、48h NOD2蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论:烟曲霉肺部感染后肺组织中NOD相关蛋白(尤其是NOD2)表达增加,提示NOD相关蛋白尤其是NOD2与烟曲霉肺部感染有关,可能参与了抗烟曲霉肺部感染的免疫反应。 第二部分A549、THP1细胞中NOD2蛋白的表达与烟曲霉孢子刺激及TNF-α分泌的相关性研究 目的:观察灭活烟曲霉孢子刺激人肺泡上皮细胞株A549及人单核/吞噬细胞株THP1后细胞中NOD2蛋白和NOD2蛋白的下游物RIP2激酶的表达,以及MDP对Af孢子刺激上述细胞分泌TNF-α的影响,探讨NOD2蛋白在机体抗烟曲霉感染免疫反应中的作用。方法:(1)透射电镜观察A549、THP1细胞与烟曲霉孢 子孵育10h、24h、48h后细胞及胞浆内孢子的形态。(2)Real-time PCR检测A549、THP1细胞在烟曲霉孢子刺激前(0h)、后24h、48h NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表达。(3)Real-time PCR检测不同刺激强度的烟曲霉孢子刺激A549、THP1细胞后NOD2 mRNA表达。(4)免疫荧光法观察烟曲霉孢子刺激A549细胞后NOD2蛋白的表达。(5)采用免疫沉降后western blot的方法检测不同刺激强度的烟曲霉孢子刺激A549、THP1细胞后NOD2蛋白的表达。(6)ELISA法检测烟曲霉孢子单独和联合NOD2的特异性配体MDP刺激A549、THP1细胞后TNF-α的分泌。结果:(1)烟曲霉孢子与A549、THP1孵育10h后胞浆内即可见到吞噬的孢子,24h时溶酶体内可见到部分消化状态的烟曲霉孢子。(2)A549、THP1细胞在烟曲霉孢子刺激后24h NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表达明显上调,与0h比较差异有统计学意义(P<0.05)。48h NOD2、RIP2、TNF-α mRNA表达均减少。(3)烟曲霉孢子刺激A549、THP1细胞后NOD2 mRNA表达水平随刺激强度的增加而上调,各组间表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。(4)免疫荧光法可见烟曲霉孢子刺激后NOD2蛋白表达增加。(5)烟曲霉孢子刺激A549、THP1细胞后NOD2蛋白的表达增加,不同刺激强度组间差异有统计学意义(P<0.05)。(6)空白对照组、MDP单独刺激、烟曲霉孢子单独刺激、烟曲霉孢子联合MDP刺激组4组A549细胞培养液中TNF-α含量分别为10.46±0.70、11.36±1.20、12.63±2.76、13.94±3.42 pg/ml;4组THP1细胞培养液中TNF-α含量分别为27.40±5.72、27.93±9.11、32.63±4.71、82.13±10.76 pg/ml。MDP能够显著增加烟曲霉孢子刺激后细胞TNF-α的分泌(P<0.05)。结论:NOD2蛋白的表达与烟曲霉孢子的吞噬和消化密切相关,并在促进TNF-α分泌方面发挥一定作用。其作用可能是作为PRRs识别烟曲霉孢子的降解产物,并通过RIP2激酶激活下游信号通路,促进TNF-α分泌。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R519

【共引文献】
中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 汤斌;Asp f2变应原的分子生物学研究[D];第一军医大学;2001年
2 王莉;侵袭性曲霉感染实验室检测的基础与临床研究[D];第三军医大学;2004年
3 廖军;肺泡巨噬细胞与烟曲霉相互作用的实验研究[D];第三军医大学;2005年
4 刘军;深部真菌感染的快速分子诊断及其临床应用研究[D];中国协和医科大学;2005年
5 祝敏芳;独立生长因子1在内毒素耐受中的作用研究[D];复旦大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 顾克菊;免疫抑制宿主Toll样受体表达及对烟曲霉菌感染免疫应答[D];第四军医大学;2005年
2 蒋彤;肺病患者呼吸道真菌的检测及分子鉴定[D];第三军医大学;2007年
3 李晓瑾;dsRNA介导的RNAi沉默烟曲霉菌毒力相关基因arp1和nudC的研究[D];第四军医大学;2007年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 章君华;徐键;;模式识别受体基因多态性与输卵管沙眼衣原体感染[J];国际生殖健康/计划生育杂志;2010年04期
2 ;[J];;年期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 张辉军;NOD蛋白在烟曲霉感染小鼠肺组织中的表达及对烟曲霉孢子的识别机制[D];复旦大学;2006年
中国知网广告投放
相关机构
>复旦大学
相关作者
>张辉军
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026