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雌、孕激素对卵巢上皮性癌细胞转移及其信号传导通路的影响

华克勤  
【摘要】:前言 尽管多年来肿瘤诊断、治疗等方面的研究已经有了长足进展,但是有关肿瘤转移的机制仍然不明确,肿瘤转移仍是目前大多数肿瘤患者的主要死亡原因,故肿瘤细胞转移机制研究已成为肿瘤研究的热点与重点。 卵巢透明细胞癌和卵巢浆液性腺癌为恶性程度较高、易转移、复发率高、预后差的两种组织学类型。卵巢浆液性腺癌占卵巢癌的50~60%左右,具有高度侵袭性,易早期发生淋巴管脉管浸润,易发生盆、腹腔播散,预后差。卵巢透明细胞癌仅占卵巢癌4~6%,发现时虽然多达60%的为Ⅰ期,但是卵巢透明细胞癌具有早期转移、早期复发、5年存活率低、预后差的特点,故日益引起国内外妇科肿瘤研究者的关注。 本课题从临床与基础两方面,对临床资料完整的良性卵巢浆液性腺瘤、交界性卵巢浆液性腺瘤、卵巢浆液性腺癌和原发性卵巢透亮细胞癌组织标本进行ER、PR、nm23—H1、E—cadherin、AKT、pAKT蛋白表达的检测,并分析其在卵巢上皮性癌患者预后中的作用及与肿瘤转移的关系;并采用分子生物学技术,了解雌、孕激素对这些蛋白的调节作用及其信号传导通路,为临床理解卵巢浆液性腺癌与透明细胞癌的特征与发展,提供理论依据。 Ⅰ 临床研究 目的:探讨ER、PR、nm23—H1、E—cadherin、AKT、pAKT蛋白表达与卵巢上皮性肿瘤生物学行为及其预后的关系。 方法:采用免疫组织化学方法检测卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌、交界性卵巢浆液性囊腺瘤、卵巢浆液性囊腺瘤组织标本ER、PR、nm23—H1、E—cadherin、AKT、pAKT蛋白表达。 结果:卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌ER、PR、nm23-H1、E—cadherin阴性表达或低表达,而AKT、pAKT则阳性表达或高表达。这些异常表达均与临床期别、细胞分化、淋巴转移及复发密切相关。 结论:ER、PR、nm23—H1、E—cadherin阴性表达或低表达与AKT、pAKT阳性表达或高表达的卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌预后较差。 Ⅱ 基础研究 采用分子生物学技术,了解雌、孕激素对肿瘤转移相关蛋白nm23—H1、E— cadherin、AKT、pAKT表达的调节作用及其信号传导通路,为临床理解卵巢透明细胞癌与卵巢浆液性腺癌的特征与发展,提供理论依据。 第一部分 雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌转移的影响 目的:探讨雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌迁移的作用及其对转移抑制基因nm23—H1蛋白表达的影响。 方法:以蛋白印迹法检测雌、孕激素作用后,ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白的表达改变,了解nm23—H1蛋白的表达量与雌、孕激素作用时间及剂量的关系。通过细胞划痕法,观察雌、孕激素作用24小时、48小时后,细胞向划痕区弥合情况。应用transwell方法,计数移至微孔膜下的细胞数,评价其转移的能力。 结果:①17-β雌二醇可降低ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达;醋酸甲羟孕酮则增加ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达,作用呈浓度和时间效应;②17-β雌二醇可增强ES-2、SKOV3细胞的迁移能力;醋酸甲羟孕酮则减弱ES-2、SKOV3细胞的迁移能力。 结论:雌激素可通过降调ES-2、SKOV3细胞转移抑制基因nm23—H1蛋白表达,促进肿瘤细胞的转移。降调作用与雌激素浓度及作用时间呈负相关;孕激素升调ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白的表达、减缓肿瘤细胞的转移。升调作用与孕激素浓度及作用时间呈正相关。 第二部分雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌转移相关信号传导通路的研究 目的:研究雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌转移的作用及其对nm23—H1蛋白表达影响的信号传导通路的研究。 方法:以蛋白印迹法检测雌、孕激素作用后,ES-2、SKOV3细胞AKT、pAKT蛋白表达的改变,并了解AKT、pAKT蛋白的表达量与雌、孕激素作用时间及剂量的关系。以AKTRNA干扰技术处理后,蛋白印迹法检测雌、孕激素作用对ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达的影响。蛋白印迹法检测雌、孕激素作用于ES-2、SKOV3细胞过程中,PI3K/AKT及MAPK通路抑制剂对ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达的影响。应用transwell方法,评价AKT RNA干扰及PI3K/AKT或MAPK通路抑制剂对ES-2、SKOV3细胞转移能力的影响。 结果:①雌激素可增加ES—2、SKOV3细胞pAKT蛋白表达;孕激素则降低ES-2、SKOV3细胞pAKT蛋白表达。两者作用均呈剂量和时间效应;②雌激素可通过激活 AKT磷酸化信号传导通路,降调细胞转移抑制基因nm23—H1蛋白表达;孕激素通过抑制AKT磷酸化信号传导通路,升调细胞转移抑制基因nm23—H1蛋白表达;③雌激素与PI3K/AKT抑制剂同时作用或AKT的SiRNA干扰后,减弱雌激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白升调节作用,减弱雌激素对ES—2、SKOV3细胞促进转移的能力;孕激素与PI3K/AKT抑制剂同时作用或AKT的SiRNA干扰后,减弱孕激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白降调节作用,减弱孕激素对ES—2、SKOV3细胞抑制转移的能力。而MAPK信号传导通路抑制剂则对性激素作用于ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达及细胞转移无影响。 结论:雌、孕激素可通过细胞内PI3K/AKT磷酸化信号通路调控nm23—H1蛋白表达。 第三部分 雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌HIF—1α蛋白表达的调控 目的:研究雌、孕激素对卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌HIF—1α蛋白表达的影响及HIF—1α与nm23—H1的关系。 方法:以蛋白印迹法检测雌、孕激素作用后,ES-2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达的改变,并了解HIF—1α蛋白表达量与雌、孕激素作用时间及剂量的关系。以AKT RNA干扰技术处理后,以蛋白印迹法检测雌、孕激素作用对ES-2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达影响。以蛋白印迹法检测雌、孕激素在作用于ES-2、SKOV3细胞过程中,PI3K/AKT及MAPK通路抑制剂对ES-2、SKOV3细胞HIF-1α蛋白表达影响。以HIF RNA干扰技术处理后,采用蛋白印迹法检测雌、孕激素作用对ES-2、SKOV3细胞nm23-H1蛋白表达影响。采取HIF过表达的方法,以蛋白印迹法检测雌、孕激素作用对ES-2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达影响。 结果:①雌激素可增加ES-2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达;孕激素则降低ES-2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达。两者作用均呈剂量与时间效应;②雌激素通过激活AKT磷酸化信号传导通路,升调HIF—1α蛋白表达;孕激素通过抑制AKT磷酸化信号传导通路,降凋HIF—1α蛋白表达;③雌激素与PI3K/AKT抑制剂同时作用,减弱雌激素对ES—2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达的升调节作用;孕激素与PI3K/AKT抑制剂同时作用,抑制孕激素对HIF—1α蛋白表达的降调节作用。MAPK信号传导通路抑制剂对性激素作用于ES—2、SKOV3细胞HIF—1α蛋白表达无调节作用;④当HIF—1α过表达时,雌激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达降调节作用增强;HIF—1α RNAi干扰后,雌激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达降调节作用减弱。当HIF—1α过表达时,孕激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表 达升调节作用增强;HIF—1α RNAi干扰后,孕激素对ES—2、SKOV3细胞nm23—H1蛋白表达升调节作用减弱。 结论:雌、孕激素可通过细胞内PI3K—AKT磷酸化信号通路调控HIF—1α蛋白表达。HIF—1α又是参与调控nm23—H1蛋白表达的一个上游信号,而细胞外信号调节酶MAPK通路对其无影响。 课题总结 1、ER、PR、nm23—H1、E—cadherin阴性表达或低表达及AKT、pAKT阳性表达或高表达的卵巢透明细胞癌、卵巢浆液性腺癌预后较差。 2、雌激素可通过细胞内PI3K/AKT磷酸化信号通路上调ES—2、SKOV3细胞HIF-1α蛋白表达,并下调nm23-H1蛋白表达,从而促进卵巢癌细胞的转移。


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