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《复旦大学》 2006年
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乳腺癌中IKKβ与p21~(CIP1/WAF1)的相关性研究

平波  
【摘要】: p21~(CIPI/WAFI)(p21)对肿瘤发生发展具有双向调控作用。一方面,p21蛋白在细胞核内与CDK复合体和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)结合,引起细胞生长停滞及DNA合成抑制。另一方面,p21可在胞浆内抑制凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)、caspase-3和Rho激酶等有肿瘤抑制作用的蛋白,起到抗凋亡,促进肿瘤细胞浸润及转移的作用。已知胞浆p21蛋白表达为乳腺癌预后不良标志。 IκB激酶β(IκB kinaseβ,IKKβ)为IKK复合体的催化亚单位之一。受细胞因子、感染等因素作用下,IKKβ被活化而发挥其激酶作用。IκBα为其底物之一。IKKβ磷酸化并降解IκBα,释放并活化核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)。NF-κB是很多抗凋亡、促肿瘤和促血管生成基因的转录活化因子。新近又发现IKKβ可磷酸化并阻碍Foxo3A的抑癌作用。大量证据表明IKKβ参与了促进细胞生长、肿瘤进展和肿瘤细胞耐药性形成等机制,而且IKK组成性激活可见于多种恶性肿瘤组织和细胞系中,如胰腺癌,造血系统恶性肿瘤以及乳腺癌。因此IKKβ已经成为一个有极大发展潜力的肿瘤治疗的靶目标。IKKβ抑制剂的开发近年来发展迅速。 为进一步发掘IKKβ在肿瘤发生发展过程的功能,我们回顾性分析了人乳腺癌标本的免疫组化档案,以期发现IKKβ与其它在细胞增殖、细胞周期调控和凋亡抑制等过程中发挥重要作用的蛋白质之间可能存在的联系。由此发现乳腺癌组织中,IKKβ蛋白与总体及胞浆p21蛋白水平正相关。由于位于IKKβ上游的TNFα能诱导乳腺癌细胞系中p21的表达,且所诱导的p21有抗凋亡作用。因此我们进一步研究了细胞系中IKKβ是否对p21蛋白,包括总体和不同细胞组分的p21蛋白有调控作用及其可能的机制。研究共分为二个部分。 第一部分乳腺癌中IKKβ与p21蛋白表达的相关性和调控关系研究 目的:观察乳腺癌组织中IKKβ与总体、胞浆及胞核p21蛋白免疫组化染色的相关性,并在细胞系中检验IKKβ对不同细胞组分中p21蛋白表达可能存在的调控作用。 方法:回顾性分析128例原发性乳腺癌标本中IKKβ和p21的免疫组化结果。免疫组化使用ABC法。按照肿瘤细胞中阳性细胞的百分比,对IKKβ表达阳性率、p21总体以及在胞核胞浆不同部位的表达阳性率进行分级,并用Pearson相关分析法检验其相关性。另建立乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-453的IKKβ稳定表达细胞系,即MCF-7β5,β12和MDA-MB-453β16,β20,以及稳定转染pCDNA3载体的对照细胞系MCF-7 v2/MDA-MB-453 vl。用Western blot法分析这些细胞系及野生型和IKKβ基因敲除(IKKβknockout,IKKβ-/-)的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)中p21的总蛋白水平,并对上述稳定细胞系作胞浆胞核分离,比较不同细胞组分中的p21蛋白水平。 结果:免疫组化结果经统计学检验,IKKβ水平与总体p21表达相关(P=0.006),与胞浆p21表达相关(P=0.001),但与核p21表达无显著相关(P=0.309)。Western blot示p21总蛋白水平在IKKβ稳定表达细胞系中明显高于对照细胞系,在野生型MEF中高于IKKβ-/-MEF;胞浆p21蛋白水平在IKKβ稳定表达细胞系中明显高于对照细胞系,而胞核p21蛋白水平无明显差异。 结论:人乳腺癌组织中IKKβ表达与总体p21和胞浆p21蛋白水平呈正相关,细胞系中IKKβ高表达者总体和胞浆p21蛋白水平增高,提示IKKβ有上调总体和胞浆p21蛋白表达的作用。 第二部分IKKβ上调总体和胞浆p21表达的机制研究 目的:首先拟从蛋白稳定性、mRNA和启动子转录水平等多层面研究IKKβ如何调控总体p21蛋白水平。其次研究可导致p21胞浆表达的Akt是否参与IKKβ对胞浆p21蛋白的上调作用,探讨IKKβ是否对Akt表达有调控作用。 方法:IKKβ调控总体p21蛋白水平的机制研究包括:Western blot法比较经放线菌酮处理蛋白质合成抑制的IKKβ稳定表达细胞系和对照细胞系中p21蛋白降解程度;RT-PCR法检测IKKβ稳定表达细胞系和对照细胞系的p21 mRNA水平;以及双荧光素酶报告基因分析系统检测转染入IKKβ稳定表达细胞系和对照细胞系,以及野生型和IKKβ-/-MEF中的p21启动子WWP-Luc的转录活性。WWP-Luc为融合有1个萤火虫荧光酶报告基因的野生型p21启动子。 IKKβ调胞浆p21蛋白表达的机制研究着重于IKKβ是否经Akt调控胞浆p21蛋白表达,包括:Western blot法观察经Akt上游的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,P13K)抑制剂LY294002处理后IKKβ稳定表达细胞系和对照细胞系胞浆和胞核p21蛋白表达水平的变化;IKKβ稳定表达细胞系和对照细胞系中Akt总蛋白和473位丝氨酸(Ser 473)磷酸化的Akt蛋白水平;经IKK抑制剂Wedelolactone处理后,Akt总蛋白和磷酸化蛋白水平的变化。 结果:p21蛋白稳定性不受IKKβ过表达的影响。p21 mRNA水平在IKKβ稳定表达细胞系高于对照细胞系。p21启动子转录活性在IKKβ稳定表达细胞系高于对照细胞系,在IKKβ野生型MEF中高于IKKβ-/-MEF。LY294002处理后伴随磷酸化的Akt蛋白水平下降,胞浆p21蛋白水平均下降,在IKKβ稳定表达细胞系中降幅明显大于对照细胞系,且二组间原有差异明显缩小。磷酸化Akt蛋白水平在IKKβ稳定表达细胞系中高于对照细胞系,而Akt总蛋白水平无显著变化。IKK抑制剂Wedelolactone处理使磷酸化的Akt蛋白水平下降,但不影响Akt总蛋白水平。 结论:IKKβ可通过提高p21mRNA水平及p21启动子转录活性来上调总体p21蛋白水平。Akt参与IKKβ介导的胞浆p21蛋白积聚,IKKβ可能通过增加Akt磷酸化水平来上调胞浆p21蛋白表达。IKKβ有上调Akt活性的作用,且不是通过提高Akt总蛋白水平所实现的。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R737.9

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