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《复旦大学》 2005年
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新型抗凝、防栓剂

莫炜  
【摘要】: 天然水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂,从医用水蛭的唾液腺中提取而得。为65-66个氨基酸残基的无糖基化的单链多肽,分子量约7,000Da,N端为活性中心区,能插入凝血酶的活性中心,抑制凝血酶活性;N端区域所含3对二硫键对空间构象起稳定作用;C端含有较多的酸性氨基酸,能与凝血酶分子碱性氨基酸富集的区域特异性结合,与其强烈的抗凝活性也有重要关系。水蛭素对凝血酶有很高的亲和力,它与凝血酶形成摩尔比为1:1的非共价结合的可逆复合物,使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力,抑制纤维蛋白的凝固,同时它也能阻断凝血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小板反应,所以极低浓度的水蛭素即可抑制凝血酶,显示抑制血液凝固等功效。基于水蛭素的这些特点,用它作为防治血栓的药物有诸多优点,(1)专一性强,直接特异性抑制凝血酶活性,不良反应少而轻;(2)分子量小,几乎没有抗原性;(3)小分子蛋白质,几乎没有毒性。 基于对天然水蛭素构效关系的深入研究,在保留天然水蛭素原有活性的基础上,将Arg-Gly-Asp(RGD)融合在水蛭素分子的合理部位,由此形成新型分子,然后构建了含RGD编码顺序的水蛭素衍生物cDNA克隆RGD-Hirudin-pPIC9K,表达质粒转化毕赤酵母后,经筛选获得快型高表达菌株,并建立工程菌株。发酵罐大量培养工程菌,经甲醇诱导后,从培养液上清纯化表达产物,并证明表达产物兼有抗凝血酶和抗血小板聚集的双重功能,我们将其命名为重组双功能水蛭素(r-RGD-Hirudin)。 药效学研究证明,r-RGD-Hirudin用于血管吻合术后抗凝、防栓治疗,疗效确切。治疗剂量比野生型水蛭素降低2-3倍,未见出血等不良反应,预计临床试用也会安全、有效。 利用超,临界CO_2包衣技术,将聚乳酸等包衣材料均匀包覆在药物颗粒表面,形成r-RGD-Hirudin的口服制剂,能抵抗胃酸和消化酶对药物的降解作用,口服后6-8小时,药物通过结肠吸收。这种技术可用于其他蛋白质/多肽类药物的特殊制剂的研究。 一、基于蛋白质构效关系研究,设计和研制r-RGD-Hirudin 经过计算机分子模拟,设计了新型RGD-Hirudin分子。根据酵母偏爱密码子对天然水蛭素基因的核苷酸序列进行优化,并在合理位置融合了Arg-Gly-Asp(RGD)三肽编码序列,合成目的基因。将全合成的目的基因与毕赤酵母载体pPIC9K质粒重组构建表达质粒,转化毕赤酵母GS115宿主菌,经G_(418)筛选得到高表达的阳性克隆,PCR鉴定为甲醇利用快型(Mut~+)。在摇瓶实现高效、稳定和分泌性表达r-RGD-Hirudin;表达量达0.1g/L。 分离、纯化表达产物,经核磁共振试验,结果显示与天然水蛭素相比,构成r-RGD-Hirudin分子空间构象最重要的4个氨基酸,即Tyr3,His51,Phe56和Tyr64的芳环上的质子的化学位移几乎没有什么变化,说明r-RGD-Hirudin的空间结构没有因为RGD三肽序列的引入而产生明显的变化。凝血酶滴定法测定r-RGD-Hirndin的抗凝血酶比活性大于10,000ATU/mg,和wt-Hirudin几乎没有差别;比浊法测定r-RGD-Hirudin抗血小板聚集比活性,终浓度1.5μg/mL,血小板聚集抑制率为10-20%,说明r-RGD-Hirudin具有抗血小板聚集的功能。放射竞争抑制试验显示r-RGD-Hirudin竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合,半数抑制浓度为0.4μmol/L;r-RGD-Hirudin与血小板结合的亲和力比纤维蛋白原大37倍。利用流式细胞技术研究了r-RGD-Hirudin与血小板膜GPⅡb/Ⅲa的亲和力,与临床常用的抗GPⅡb/Ⅲa药物——硫酸氢氯吡格雷相比,r-RGD-Hirudin对GPⅡb/Ⅲa的半数抑制浓度为0.3μmol/L;以完全抑制血小板活性的药物终浓度相比,r-RGD-Hirudin与血小板结合能力比硫酸氢氯吡格雷大500倍。。 二、r-RGD-Hirudin的中试研究 在实验室初步表达试验及优化试验的基础上,采用30L NBS发酵罐(BioFlo4500)研究溶氧、接种密度、碳源、诱导时密度、诱导时间、甲醇的具体控制等发酵工艺的最适参数。 工程酵母菌(RGD-Hirudin-GS115)经3天发酵,离心后取培养液上清,超滤浓缩,凝胶过滤层析,离子交换层析后,得到比活性为12,000ATU/mg的r-RGD-Hirudin,回收率大于50%,产率大于1.0g/L。纯化后的r-RGD-Hirudin经过SDS-PAGE、LC/MS、等电聚焦电泳、Western-Blot和紫外吸收光谱等分析,其纯度达到97%以上,分子量为7,030Da、等电点为pH 4.2左右,与野生型水蛭素相符,证明表达产物为水蛭素的衍生物,抗凝血酶活性测定和抗血小板聚集活性分析证明r-RGD-Hirndin具有抑制凝血酶活性和抑制ADP诱导的血小板聚集双重功能。 HPLC分析r-RGD-Hirndin纯品含2个主峰,进一步分析证明第一主峰是分子量为7,030Da,含量大于70%,含65个氨基酸残基的r-RGD-Hirndin,第二主峰是分子量为7,180Da,含量小于30%,含66个氨基酸残基的r-RGD-Hirudin,两者含量总和大于97%。分别测定两者的抗凝血酶比活性和抗血小板聚集比活性,几乎没有差别,说明两者都是r-RGD-Hirndin。 纯化后样品含有磷酸盐、氯化钠、r-RGD-Hirndin三种溶质,三种溶质的总含量为2-3%,以甘露醇为辅剂,制成静脉注射用粉针剂,冻干品色泽均匀,稳定性试验表明储存于4-8℃2年以上,活性无明显改变。 对中试产品的质量控制作研究,原液的质量控制和成品的质量控制,共24项指标均符合静脉注射用药的国家质量标准。 三、r-RGD-Hirudin的药效学研究和安全性评价 建立了大鼠股动脉吻合术后抗凝、防栓治疗模型和兔颈总动脉吻合术后抗凝防栓治疗模型。大鼠腹腔注射r-RGD-Hirndin 0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg。每日用药1次,连续3天,首次静脉注射,其后腹腔注射;家兔首次静脉注射r-RGD-Hirndin,以后皮下注射,剂量为0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg,每日用药2次,连续3天。试验结果证明r-RGD-Hirudin用于血管吻合术后抗凝治疗,疗效优于野生型水蛭素和肝素,降低血黏度,抗凝、防栓作用更强。临床应用剂量可望比野生型水蛭素降低2-3倍,有显著疗效,未见出血等不良反应。 免疫原性试验显示豚鼠腹腔注射r-RGD-Hirudin 3倍临床拟单次使用剂量,隔天注射,共3次,2周和3周后静脉注射6倍临床拟单次使用剂量的r-RGD-Hirudin,未见过敏性休克;致敏2周和3周,取血,ELISA测定抗r-RGD-Hirndin抗体滴度,几乎检测不到抗体。 四、r-RGD-Hirudin的特殊制剂的研究 利用超临界CO_2流体包衣技术,以聚乳酸为包衣材料包覆r-RGD-Hirndin药物 颗粒,制成口服制剂。口服后6-8小时,血液中出现药物浓度高峰,血浆部分凝血活酶时间延长2倍。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R284

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【参考文献】
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