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《复旦大学》 2006年
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局部内皮素系统在腹膜纤维化形成中的作用

孙芳  
【摘要】:研究目的:本课题将从临床观察持续性非卧床腹膜透析(CAPD)患者腹膜透析液内皮素-1(endothelin—1,ET—1)水平,并从细胞水平探讨局部内皮素系统在腹膜纤维化形成中的作用机制,通过体外实验应用非选择性内皮素受体拮抗剂(ETA/ETB受体拮抗剂PD142893)对腹膜间皮细胞进行干预,研究腹膜局部内皮素系统在腹膜纤维化形成中的作用,探讨腹膜纤维化的发生机制及治疗策略。 研究方法:1.在本院定期随访的CAPD患者中选取26例患者,放免法测定透析液及血浆中ET—1的表达,通过腹膜平衡试验(PET)确定患者腹膜转运类型,记录超滤量。通过Pearson相关分析,单因素方差分析和线性回归方程,分析血浆与腹透液ET-1的表达和意义。以人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)为研究对象,采用放免法、免疫细胞化学检测不同时间、不同浓度的葡萄糖、甘露醇作用下人腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell,HPMC)分泌的ET-1水平。采用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测局部内皮素系统ET-1、内皮素受体(ETAR、ETBR)及内皮素转化酶(ECE)的基因表达。2.相差显微镜下观察HPMC细胞的形态改变,免疫细胞化学观察细胞角蛋白(CK)、波形蛋白的表达。氚标胸腺嘧啶核苷渗入法测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。乳酸脱氢酶(LDH)测定细胞损伤。3.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、放免法检测不同浓度的葡萄糖、ET-1作用下Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤连蛋白(Fn)及转化生长因子-β1(TGF-β1)、白介素-1β(IL-1β)蛋白水平,RT-PCR检测ColⅣ、Fn、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)基因表达,并在高糖和ET-1基础上加入非选择性内皮素受体拮抗剂(PD142893),观察上述指标的变化。免疫印迹法(Westernblot)检测p38MAPK、磷酸化p38MAPK(P-p38MAPK)蛋白水平。 研究结果:1.透析液中ET-1的实测值明显高于预测值(P<0.05)。不同腹膜转运类型血浆、腹膜透析液ET-1的浓度、内皮素透析液血浆比值(D/P_(ET-1))各组间均无显著差异(P>0.05)。净超滤量与透析液ET-1的浓度呈负相关。正常HPMC分泌低水平的ET-1,高浓度的葡萄糖可诱导HPMC分泌ET-1增加,呈时间和剂量依赖。HPMC表达完整的ET-1、ETAR、ETBR、ECEmRNA。高糖作用下ET-1、ETAR、ETBRmRNA表达增强。2.ET-1作用下,HPMC出现梭形改变,CK8和波形蛋白仍为强阳性表达。ET-1促进HPMC细胞DNA合成,呈剂量依赖。ET-1增加HPMC的损伤。3.ET-1促进HPMC分泌ColⅣ、Fn及ColⅣ、Fn、MMP-2mRNA的表达。 PD142893可下调高糖诱导的ColⅣ、Fn和MMP-2。ET-1刺激HPMC分泌TGF-β1、IL-1β,呈剂量依赖。高糖和ET-1可激活HPMC细胞的p38MAPK信号通路,而PD142893通过阻断ET—1的作用,部分抑制高糖激活的p38MAPK信号通路。 结论:1.腹腔ET—1可能部分来源于腹腔局部自分泌和旁分泌,腹膜超滤功能受损可能与腹腔ET-1水平有关。人腹膜间皮细胞存在内皮素系统,高浓度葡萄糖诱导其表达增加,HPMC可能是腹膜局部内皮素-1的来源之一。2.ET-1对HPMC有促收缩作用,促增殖作用,同时加重HPMC损伤。ET—1未使HPMC发生表型转化。3.ET-1有促HPMC细胞外基质形成作用。ET-1诱导的ECM的形成可能与致纤维化因子TGF-β1的途径有关。ET-1有促炎症作用,进一步促进ECM形成。ET-1的上述作用可能部分通过激活p38 MAPK信号通路。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R459.5

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【参考文献】
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