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《复旦大学》 2004年
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丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶BRSK2功能的初步研究

郭泽坤  
【摘要】: 蛋白激酶通过对蛋白底物的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的磷酸化调节蛋白质的生物活性状态,这一过程在许多细胞活动中起着十分重要的作用,例如,细胞内外信号传导,细胞内运输,细胞周期进程等。 我们通过电子杂交的方法从Genbank数据库中获得了BRSK2基因序列,该基因含有2025bp的开放阅读框,编码674个氨基酸残基,定位于11q15.5,含有21个外显子。BRSK2的氨基酸序列19-270位氨基酸残基编码一个Ser/Thr蛋白质激酶结构域,根据其激酶结构域的氨基酸序列同源性,将其归类于CAMK蛋白激酶家族的AMPK亚家族。BRSK2氨基酸序列的10-674位氨基酸残基还含有一个与细胞周期调控、细胞分裂以及染色体分离相关的KOG0588结构域,而且BRSK2是AMPK家族成员中唯一具有完整该结构域的蛋白激酶。组织表达谱分析表明BRSK2在脑和胰隙中呈现特异性的高表达,并且胰腺组织中的表达丰度要比脑组织中的表达丰度高10倍以上。免疫荧光实验将BRSK2在HeLa细胞内定位于核周区域。 根据BRSK2激酶结构域与AMPK的同源性,我们用AMPK的底物SAMS多肽来检测BRSK2的激酶活性,实验结果表明BRSK2能够磷酸化SAMS多肽,而不能磷酸化突变多肽SAMA。对BRSK2细胞功能的研究发现BRSK2在葡萄糖饥饿胁迫条件下能够促进细胞存活率,抑制蛋白质合成,阻滞细胞周期在G2/M期,以及激活AP1、NFAT、HSE等细胞信号转导通路。 我们在BRSK2发现了一个PKA的磷酸化位点Thr260,实验证明Thr260能够在体外被PKA磷酸化,并且PKA的磷酸化能够促进BRSK2的活性,将Thr260突变为丙氨酸,可导致激酶活性的降低,并导致BRSK2在促进细胞存活、蛋白质合成抑制、G2/M期阻滞和AP1激活等方面的功能的部分降低。 已经有报道证明LKB1能够磷酸化激活BRSK2的Thr174,Thr174的突变可导致BRSK2活性的丧失。我们对比了Thr174以及Thr260位点的突变对BRSK2细胞功能的影响。实验结果表明Thr174位点的突变导致BRSK2功能的完全丧失,而Thr260的突变仅导致BRSK2功能的部分丧失,说明Thr174位点的磷酸化是BRSK2活性和功能所必需,该位点的突变将导致BRSK2功能的完全丧失,而Thr260的磷酸化对激酶活性具有调控作用,可能调控Thr174位点的磷酸化。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q55

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