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N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V表达受阻引起细胞ER stress的研究

方欢  
【摘要】: N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnT-V)是存在于高尔基体中的N糖链外链加工酶,催化UDP-GlcNAc中GlcNAc转移到N糖链五糖核心上α甘露糖(αman)形成β1,6键,是合成C2 C2,6型三天线和C2,4C2,6型四天线N糖链所必需的,细胞表面β1,6分支结构的多少主要取决于GnT-V活性及表达的高低。大量研究表明肿瘤细胞侵袭很大程度上是由于细胞表面形成过量的N糖链β1,6分支结构所致,过多的β1,6分支结构导致生成多天线的N糖链结构改变了糖蛋白分子的生物学性状,使肿瘤细胞粘附功能发生异常而易发生向周围组织侵袭。本教研室以往的研究发现用反义核酸技术阻断体外培养H7721人肝癌细胞的GnT-V基因表达,建立了GnT-V基因沉默细胞株GnT-V-AS/H7721,并且观察到由于GnT-V基因沉默而引起的细胞表型改变,例如生长缓慢,对血清饥饿耐受下降,对凋亡诱导剂全反式维甲酸(ATRA)更加敏感等。为探讨其机制用基因芯片技术(DNA microarray)对H7721细胞和GnT-V-AS/H7721细胞基因转录水平表达谱进行比较,发现GnT-V-AS/HH7721细胞基因表达谱具有内质网应激(ER stress)的特征。ER stress是由于内质网内未折叠蛋白堆积到一定程度引起的一种真核细胞应激现象,是近年来新发现的重要的凋亡起始机制之一,目前国外对ER stress的研究报导较多,国内尚未见研究成果报导。本文以H7721细胞为材料从分子水平对GnT-V表达受阻后引起ER stress的现象进行了较为系统的研究并探讨其产生机制。 一.GnT-V-AS/H7721和H7721细胞基因转录水平表达情况的总体比较 本文运用基因芯片技术对GnT-V-AS/H7721和H7721细胞基因转录水平的表达进行检测和比较,结果表明GnT-V-AS/H7721细胞基因转录水平具有以下特点:(1)介导内质网中蛋白折叠的伴侣蛋白如BIP、蛋白质二硫键异构酶、脯氨酰肽酰异构酶D和A以及一些热休克蛋白表达上调为H7721细胞的3倍以上,其中BIP更上调为8.21倍,(2)蛋白质合成系统的一些基因表达下降,如S5、S10、S14、S19、S21、L8、L10、L18、L27、L29、L37的表达仅为H7721细胞的0.11—0.45,(3)涉及泛肽和蛋白酶体的蛋白降解途径的基因表达上调,如泛肽水解酶,E2-泛肽结合酶,蛋白酶体亚基P40,P55,HC3,HC8,HC9表达为H7721细胞的2.6—6.6倍。通过复习文献,表明这些现象符合近年来才发现的,普遍存在于真核细胞中的ER stress现象,因此推测GnT-V表达受阻可能是GnT-V-AS/H7721细胞产生ER stress的起始原因。 二.GnT-V-AS/H7721和H7721细胞ER stress过程中的关键信息分子的检测比较 为验证GnT-V-AS/H7721细胞株存在ER stress现象,本文以GnT-V-AS/H7721细胞为实验细胞,H7721细胞和二巯基苏糖醇(DTT)处理的H7721细胞作为阴性和阳性对照,检测ER stress过程中的关键分子的表达。ER stress过程中的关键分子主要有BIP、XBP1和PERK等,其中伴侣蛋白BIP是ER stress信号传导过程中最终上调的靶目标,其表达上调是公认的细胞发生ER stress标志。转录因子XBP1是哺乳动物细胞ER stress信号传导过程中的中枢性调节分子,细胞发生ER stress时其mRNA发生特异性地剪接。PERK是位于内质网的eIF2α蛋白激酶家族成员,细胞发生ER stress时特异性地发生活化,并通过磷酸化翻译起始因子eIF2α而下调细胞蛋白合成水平。对这三种ER stress关键分子的检测发现:和阴性细胞相比较,实验细胞中BIP的表达无论是蛋白水平还是转录水平都有明显的上调,但上调程度都要低于DTT处理的ER stress阳性细胞;XBP-1 mRNA在实验细胞中部分被剪接,在阳性细胞中XBP-1 mRNA完全被剪接,而在阴性细胞中其以非剪接形态存在;此外和DTT处理的ER stress阳性细胞相似,实验细胞中的PERK发生磷酸化,表明ER stress过程中通过磷酸化eIF2α抑制蛋白合成机制的活化,这和芯片所检测到的GnT-V-AS/H7721细胞蛋白合成系统水平下调相一致。这些结果表明GnT-V-AS/H7721细胞中存在有ER stress现象,并且相对于DTT引起的ER stress程度较轻,可能是慢性的ER stress过程。因有研究表明非特异性的双链RNA导入细胞可以激活胞内蛋白激酶PKR而引起eIF2α磷酸化,抑制胞内蛋白质合成系统。GnT-V-AS/H7721中含有整合的反义GnT-V cDNA,并且通过转录产生反义RNA与GnT-V的mRNA结合而起作用,反义GnT-V cDNA的整合也有可能作为非特异因素,为排除整合及双链RNA原因导致的非特异因素干扰,采用了反义寡聚核苷酸(asODN)技术阻断H7721细胞中GnT-V的表达后,结果发现BIP的表达同样发生上调,并且出现少量的剪接XBP-1 mRNA,这表明GnT-V表达受阻可以特异性地引起胞内ER stress。本教研室以往的研究发现GnT-V-AS/H7721细胞相对于H7721细胞对凋亡诱导剂ATRA更加敏感,而ER stress是引起凋亡的重要因素之一,当刺激信号过于剧烈,细胞产生的应答仍不足以克服过强的刺激信号导致的细胞损伤时,位于内质网胞浆侧的caspase12能特异地被激活并参与ER stress引起的凋亡过程,本文发现ATRA处理的GnT-V-AS/H7721细胞中存在caspase12活化,表明GnT-V-AS/H7721细胞对ATRA诱导的凋亡敏感性的增高和胞内的ER stress有关。 三.GnT-V-AS/H7721和H7721细胞内质网中N糖链合成及胞内糖蛋白N糖链结构的比较 GnT-V表达受阻可以特异性地引起细胞发生ER stress,但GnT-V是高尔基体中的N糖链外链加工酶,并不参与内质网中N糖链的合成及蛋白折叠过程。通过相关文献和NCBI数据库检索发现直接参与内质网中N糖链合成及蛋白折叠的酶和伴侣蛋白大多数是有N糖链的糖蛋白,GnT-V表达受阻后胞内N糖链外链加工方式的改变可能导致它们N糖链结构发生改变,而正确的糖链结构是糖蛋白发挥生物学功能所必需的,因此考虑GnT-V表达受阻 后内质网内N糖链合成酶和伴侣蛋白功能的异常是导致细胞ER stress的原因之一。为了研究GnT-V表达受阻对细胞N糖链合成的影响,本文以GnT-V-AS/H7721细胞为实验细胞,H7721细胞和衣霉素(tunicamycin TM)处理H7721细胞作为对照,以~3H-甘露糖掺入法研究三种细胞株糖蛋白N糖链合成的差异,结果发现GnT-V-AS/H7721细胞和阳性对照相似,二者糖蛋白N糖链合成分别下降为H7721细胞的56%和26%,证明GnT-V表达受阻后可以影响内质网中糖蛋白N糖链合成,表明内质网中的N糖链合成酶功能发生下降,导致内质网中N糖链糖蛋白糖基化异常而引起细胞发生ER stress。为了检测了GnT-V表达受阻后胞内糖蛋白N糖链结构的改变,同样以三种细胞株作为实验对象,在去除细胞膜表面糖肽后,用HRP标记的刀豆凝集素(ConA)和蔓陀罗凝集素(DSA)分析胞内糖蛋白的N糖链结构,结果发现GnT-V-AS/H7721细胞相对于H7721细胞对HRP-ConA染色增深,而对HRP-DSA染色变浅,表明GnT-V表达受阻后胞内糖蛋白N糖链β1,6-GlcNAc分支结构含量减少,说明细胞内糖蛋白N糖链结构因GnT-V表达受阻而普遍发生改变,提示内质网中N糖链合成酶及伴侣蛋白的N糖链结构也发生了改变,因此认为GnT-V表达受阻可能影响内质网中N糖链合成酶和伴侣蛋白的N糖链结构,从而影响到它们的功能,引起ER stress。


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