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《复旦大学》 2006年
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糖原合酶激酶-3β对卵巢癌细胞增殖和化疗敏感性的影响及雌、孕激素对其调节作用

曹琦  
【摘要】: 卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,尽管近年来手术和联合化疗已经取得很大进展,但是由于其发病机制至今尚不清楚,束缚了新疗法的开发,再加上棘手的化疗耐药问题,因而卵巢上皮性癌的5年生存率一直未能提高。 许多恶性肿瘤都有一个共有的特征:葡萄糖代谢率的升高。大量葡萄糖的分解代谢不仅可以为肿瘤的快速生长提供能量,而且可以为肿瘤细胞合成DNA、RNA和脂类提供前体物质,因而肿瘤细胞中常存在糖代谢相关酶类的活性异常。其中糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)兼有调节葡萄糖代谢和调节其它转录因子、结构蛋白活性等多种功能,故引起研究者们对其与肿瘤发展关系的广泛研究。但是研究结论却不一致,存在着不同的观点。有关GSK-3β与卵巢癌的研究,更是鲜见报道。本课题从细胞增殖的角度入手,用体外和体内实验,从细胞生长曲线、BrdU掺入率、细胞克隆形成能力和裸鼠成瘤实验四个不同的方面来观察GSK-3β活性改变对卵巢癌细胞的短期和长期影响;并通过检测细胞周期和细胞周期蛋白表达的变化以初步探讨GSK-3β影响卵巢癌细胞增殖的机制;同时观察提高GSK-3β活性对卵巢癌细胞的化疗增敏作用;最后,探讨了在卵巢癌发生发展过程中有重要影响的雌、孕激素对GSK-3β活性的调节作用。我们的实验结果提示GSK-3β可以影响卵巢癌细胞的增殖和化疗敏感性,雌激素和孕激素可调节卵巢癌细胞GSK-3β的活性。 本课题共分三部分:(1)GSK-3β对卵巢癌细胞增殖的影响;(2)GSK-3β活性改变对卵巢癌细胞周期的调节及其对化疗增敏作用的研究;(3)雌、孕激素对卵巢癌细胞GSK-3β活性的调节作用。 第一部分糖原合酶激酶—3β对卵巢癌细胞增殖的影响 目的探讨糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)对卵巢癌细胞增殖的影响。 方法以蛋白免疫印迹法检测总GSK-3β和丝氨酸9位点磷酸化的GSK-3β(pGSK-3β~(Set9))在卵巢癌细胞株SKOV3和ES-2中的表达水平;采用细胞计数法描记细胞生长曲线,以检测GSK-3β抑制剂对SKOV3和ES-2细胞生长的影响;将SKOV3细胞分成4组,将增加GSK-3β活性的质粒GSK-3βS9A和其空载对照质粒pCS2以及降低GSK-3β活性的质粒GID5-6和其对照质粒GID5-6LP,分别用电转法与绿色荧光蛋白(GFP)质粒,共同转染入细胞中,采用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入实验检测GSK-3β活性对卵巢癌细胞增殖的影响;利用G418筛选瞬时转染的SKOV3细胞得到稳定转染株后,采用克隆形成实验,观察改变GSK-3β的活性对卵巢癌细胞增殖的长期影响。用GSK-3β抑制剂LiCl或对照NaCl处理SKOV3细胞后,分别注射于裸鼠皮下,每只裸鼠注射5×10~6个细胞,3周后处死裸鼠,取瘤称重并用游标卡尺测量肿瘤的最长径和最短径,计算肿瘤体积。 结果SKOV3和ES-2细胞均表达GSK-3β和pGSK-3β~(Ser9),SKOV3细胞中pGSK-3β~(Ser9)的表达水平比ES-2低,而两者总GSK-3β的表达水平相似。GSK-3β抑制剂可抑制SKOV3和ES-2细胞的生长。与对照pCS2相比,转染GSK-3βS9A质粒以上调GSK-3β的活性,可增加SKOV3细胞BrdU的掺入率;相反,与其对照GID5-6LP相比,转染GID5-6质粒来下调GSK-3β的活性,可减少SKOV3细胞BrdU掺入率。分别与各自的对照质粒相比,稳定转染GSK-3βS9A可形成较多的细胞克隆,而稳定转染GID5-6则形成的细胞克隆较少。与对照NaCl相比,LiCl可抑制SKOV3细胞在裸鼠体内的生长。 结论GSK-3β具有促进卵巢癌细胞增殖的作用,抑制GSK-3β的活性可减少卵巢癌细胞的增殖。 第二部分GSK-3β活性改变对卵巢癌细胞周期的调节及其对化疗增敏作用的研究 目的探讨GSK-3β调节卵巢癌细胞增殖的机理及其对化疗敏感性的影响。 方法以电转法将提高GSK-3β活性的GSK-3βS9A质粒和降低GSK-3β活性的GID5-6质粒及其相关对照质粒与绿色荧光蛋白(GFP)质粒共同转染入卵巢癌细胞株SKOV3中,用流式细胞仪进行荧光分选,检测转染了上述质粒的细胞所处的细胞周期;用蛋白免疫印迹法检测转染上述质粒对细胞周期蛋白cyclin D1表达的影响:采用碘化丙啶(PI)染色及荧光显微镜下观察死亡细胞法筛选泰素敏感实验的适合浓度(即24h IC_(10));以GSK-3βS9A质粒和对照质粒转染SKOV3细胞后,用适当浓度的泰素处理细胞24h,采用PI染色并于荧光显微镜下计数死亡细胞数,检测泰素作用的敏感性。 结果转染GSK-3βS9A质粒,提高GSK-3β活性后,有45.5±1.7%的SKOV3细胞进入S期,而其转染对照质粒后只有37.5+2.9%的细胞进入S期;相反,转染GID5-6质粒降低GSK-3β活性后,只有26.8+2.1%的SKOV3细胞进入S期,而转染对照质粒后进入S期的细胞百分比为36.3+1.5%,差异有统计学意义(P<0.05)。转染GSK-3βS9A质粒可上调细胞周期蛋白cyclin D1的表达,而转染GID5-6质粒可下调cyclin D1的表达。泰素作用24 h的IC_(10)为0.01μmol/L,用该浓度的泰素分别处理转染了GSK-3βS9A质粒及其对照质粒的SKOV3细胞,PI染色显示转染GSK-3βS9A的细胞经泰素处理24h后,有27.2+4.1%死亡,而转染对照质粒的细胞经处理后,只有12.8+0.8%的细胞死亡,差异有统计学意义(P<0.01)。 结论GSK-3β可通过上调cyclin D1的表达水平,促进SKOV3细胞进入S期,从而使卵巢癌细胞增殖。提高GSK-3β活性可增加SKOV3细胞对泰素的敏感性。 第三部分雌、孕激素对卵巢癌细胞GSK-3β活性的调节作用 目的探讨雌激素和孕激素对卵巢癌细胞GSK-3β活性的调节作用。 方法用含有10%活性炭处理的胎牛血清的无酚红RPMI-1640培养基,预处理SKOV3细胞3天。将10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L或10~(-6)mol/L的17-β雌二醇或醋酸甲羟孕酮孵育SKOV3细胞,以DMSO为对照,48h后用蛋白免疫印迹法检测总GSK-3β和丝氨酸9位点磷酸化的GSK-3β(pGSK-3β~(Ser9))的表达水平。然后用10~(-6)mol/L的17-β雌二醇或醋酸甲羟孕酮,处理24h、48h或72h后检测总GSK-3β和pGSK-3β~(Ser9)的表达水平。 结果经预处理后,17-β雌二醇可下调SKOV3细胞pGSK-3β~(Ser9)的表达水平,并随着剂量的加大和时间的延长,作用愈明显。相反,醋酸甲羟孕酮孵育后SKOV3细胞pGSK-3β~(Ser9)的表达水平上升,并随着剂量的加大和时间的延长,作用更加显著。而总GSK-3β的表达水平没有明显变化。 结论雌激素可下调pGSK-3β~(Ser9)的表达水平,从而提高GSK-3β的活性,孕激素则可通过上调pGSK-3β~(Ser9)的表达水平而降低GSK-3β的活性,并且具有时间和剂量依赖性效应。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R737.31

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【参考文献】
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【共引文献】
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