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过继转输父系抗原anergic CD4~+T细胞诱导母—胎免疫耐受的分子机制

朱晓勇  
【摘要】: 正常生理妊娠类似于同种异体移植,作为同种移植物的胚胎在母体内存活直至分娩,实际上反映了母体对胚胎的免疫耐受;而妊娠失败多因母体对胚胎的免疫排斥所致。揭示母-胎免疫耐受的确切机制,不仅对动物及人类自然流产的防治具有重要意义,对移植免疫学和肿瘤免疫学研究亦产生深远的影响。 协同刺激分子CD80/CD86与其受体CD28结合所产生的协同刺激信号在T细胞活化、增殖、辅助性T细胞(Th)分化及效应性细胞因子分泌中起重要作用。在T细胞活化过程中,当TCR识别MHC-抗原肽启动抗原特异性第一信号后,如果缺失协同刺激信号,则可诱导T细胞产生抗原特异性无反应(anergy),而诱导T细胞产生克隆无反应被认为是形成抗原特异性免疫耐受的重要机制。移植免疫耐受的体外及体内研究均证实:移植抗原anergic T细胞具有特异性抑制移植抗原反应性T细胞(responsive T cell)的免疫应答,从而诱导移植抗原特异性免疫耐受的功能;过继转输移植抗原特异性anergic T细胞能够诱导宿主产生移植抗原特异性免疫耐受。 通过建立自然流产模型♀CBA/J×♂DBA/2,本文以非孕期CBA雌鼠来源CD4~+T细胞为反应细胞,以灭活处理的DBA/2雄鼠脾细胞为刺激抗原,加入抗CD80和抗CD86单克隆抗体共培养,诱导制备父系抗原(♂DBA/2 Ag)anergic CD4~+T细胞。将此anergic CD4~+T细胞过继转输至孕早期自然流产模型CBA孕鼠,以研究过继转输父系抗原anergic CD4~+T细胞对宿主孕鼠妊娠预后的影响及其机制。 第一部分父系抗原anergic CD4~+T细胞的制备及其生物学功能评价 目的制备父系小鼠抗原(♂DBA/2 Ag)anergic CD4~+T细胞,体外分析鉴定此anergic CD4~+T细胞的免疫生物学功能。 方法以非孕期CBA雌鼠来源CD4~+T细胞为反应细胞,以灭活处理的DBA/2雄鼠脾细胞为刺激抗原,加入抗CD80和抗CD86单克隆抗体共培养,诱导制备父系抗原(♂DBA/2 Ag)anergic CD4~+T细胞。RT-PCR测定anergic CD4~+T细胞中GRAIL(gene related to anergy in lymphocyte)的转录水平;分析anergic CD4~+T细胞对不同刺激原刺激的增殖反应;ELISA测定经父系抗原再刺激后,anergic CD4~+T细胞培养上清中Th1/Th2型细胞因子水平;MLR及Transwell鉴定anergic CD4~+T细胞对naive CD4~+T细胞的抑制性免疫调控作用及其剂量依赖性、抗原特异性,以及抑制性免疫调控作用的机制。 结果DBA/2-anergic CD4~+T细胞中,anergy特征性标志物GRAIL的转录显著增强;DBA/2-anergic CD4~+T细胞仍保持对多克隆激活剂ConA、PMA+ionomycin刺激的增殖能力,但对anti-CD3 mAb刺激以及DBA/2 Ag再刺激均无显著增殖效应;外源性IL-2能够逆转CD4~+T细胞的anergy状态;anergic CD4~+T细胞能够通过细胞与细胞间的直接接触,发挥对naive CD4~+T细胞的免疫抑制效应,而且此免疫抑制效应具有抗原特异性和剂量依赖性。 结论DBA/2-anergic CD4~+T细胞对naive CD4~+T细胞针对DBA/2 Ag的免疫应答具有抗原特异性免疫抑制作用,其免疫抑制并非细胞因子介导,而是由细胞与细胞间的直接接触所介导。 第二部分Treg在诱导父系抗原anergic CD4~+T细胞中的作用 目的揭示CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg)在诱导DBA/2-anergic CD4~+T细胞中的作用。 方法以Na(?)ve CD4~+T细胞为对照,FCM分析DBA/2-anergic CD4~+T细胞中CD4~+CD25~+T细胞亚群变化及其细胞内CTLA-4表达;RT-PCR检测Foxp3 mRNA在anergic CD4~+T细胞中的转录水平;免疫磁珠分选非孕期CBA雌鼠脾脏细胞中CD4~+CD25~+T细胞、CD4~+CD25~-T细胞;FCM鉴定CD4~+CD25~+、CD4~+CD25~-T细胞纯度;将CD4~+CD25~+、CD4~+CD25~-T细胞按不同比例混合,以灭活处理的DBA/2雄鼠脾细胞为刺激抗原,在加或不加anti-CD80/CD86 mAb的条件下进行混合淋巴细胞培养。ELISA测定混合淋巴细胞培养上清中IL-2表达水平。 结果DBA/2-anergic CD4~+T细胞中存在CD4~+CD25~+T细胞亚群的显著性扩增(P<0.05);并且此扩增的CD4~+CD25~+T细胞内CTLA-4表达以及Foxp3 mRNA转录水平均呈显著性升高(P<0.05);在删除CD4~+T细胞中的CD4~+CD25~+调节性T细胞亚群后,anti-CD80/CD86 mAb虽然仍能抑制CD4~+CD25~-T细胞对父系抗原(DBA/2 Ag)刺激的增殖反应,但其抑制效率却显著低于CD4~+T细胞组(P<0.05);父系抗原(DBA/2 Ag)刺激后CD4~+CD25~-T细胞分泌的IL-2水平显著高于CD4~+T细胞(P<0.05)。anti-B7 mAb虽然能够抑制CD4~+CD25~-T细胞分泌IL-2(P<0.01),但通过比较anti-B7 mAb作用下CD4~+CD25~-T细胞与CD4~+T细胞IL-2的分泌水平显示,前者分泌IL-2水平显著高于后者。在无anti-B7 mAb存在时,混合淋巴细胞培养体系中,随CD4~+CD25~-T细胞比例的下降和CD4~+CD25~+T细胞比例的上升,CD4~+T细胞对父系抗原(DBA/2 Ag)刺激的增殖效应的抑制逐步增强;随CD4~+T细胞中CD4~+CD25~-T细胞比例的下降和CD4~+CD25~+T细胞比例的逐步上升,anti-B7 mAb诱导anergy的效能亦逐步增强。 结论由Na(?)ve CD4~+T细胞诱导生成DBA/2-anergic CD4~+T细胞的过程中存在CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg)亚群的扩增。诱导CD4~+T细胞anergy需要Treg亚群的存在,它的存在有利于促进anti-B7 mAb诱导CD4~+T细胞anergy状态的形成。DBA/2-anergic CD4~+T细胞中扩增的Treg亚群可能通过Treg—T相互作用机制发挥免疫抑制性调节作用。即Treg通过其表面丰富表达的CTLA-4与效应性T细胞表面CD80/CD86结合,从而抑制效应性T细胞的免疫功能。 第三部分过继转输父系抗原anergic CD4~+T细胞对自然流产模型妊娠预后的影响及其机制 目的探讨过继转输DBA/2-anergic CD4~+T细胞在诱导母—胎免疫耐受中的生物学作用及其对自然流产模型妊娠预后的影响及其分子机制。 方法建立自然流产模型CBA/J×DBA/2与正常妊娠模型CBA/J×BALB/c。一组于孕第0、2天,另一组于孕第4天将DBA/2-anergic CD4~+T细胞过继转输至自然流产模型CBA孕鼠,于孕第14天观察各组宿主孕鼠的胚胎吸收率。免疫磁珠分选非孕期CBA雌鼠和正常妊娠模型CBA/J孕鼠脾脏细胞中CD4~+CD25~+T细胞、以及DBA/2-anergic CD4~+T细胞中的CD4~+CD25~+T细胞,并以CFSE标记。于孕第0、2天分别过继转输自然流产模型孕鼠,于转输后48h、96h双光子共聚焦显微镜观察各组CFSE~+CD4~+CD25~+T细胞在宿主孕鼠体内的归巢与分布;FCM分析宿主孕鼠脾脏CFSE~(+/-)T细胞内细胞因子及细胞表面协同刺激分子的表达;ELISA测定母—胎界面组织培养上清中Th1型/Th2型细胞因子表达水平;HPLC测定母—胎界面组织培养上清中的IDO活性;孕第14天计算各组孕鼠的胚胎吸收率。 结果与未经细胞转输的自然流产模型CBA孕鼠的胚胎吸收率相比,于孕第4天转输DBA/2-anergic CD4~+T细胞,未能显著改善自然流产模型宿主孕鼠的妊娠预后(P>0.05);但于孕第0、2天转输正常妊娠模型孕鼠CD4~+T细胞、DBA/2-anergic CD4~+T细胞或DBA/2-anergic CD4~+CD25~+T细胞后,宿主孕鼠的胚胎吸收率均显著下降(P<0.05);转输DBA/2-anergic CD4~+CD25~-T细胞的宿主孕鼠的胚胎吸收率虽有改善但与转输DBA/2-anergic CD4~+CD25~+T细胞相比有显著性差异(P<0.05)。转输C57BL/6-anergic CD4~+T细胞或非孕期CBA雌鼠CD4~+T细胞后,宿主孕鼠的妊娠预后均无明显改善(P>0.05)。转输正常妊娠模型CBA孕鼠的CD4~+CD25~+T细胞或DBA/2-anergic CD4~+CD25~+T细胞,宿主孕鼠的胚胎吸收率分别下降为9.4%(P<0.05)、9.1%(P<0.05)。转输后48h、96h CFSE示踪的细胞均能归巢分布至宿主孕鼠脾脏、子宫引流淋巴结和母—胎界面。与过继转输非孕期CBA/J雌鼠CD4~+CD25~+T细胞相比,转输正常妊娠模型CBA/J孕鼠CD4~+CD25~+T细胞或DBA/2-anergic CD4~+CD25~+T细胞均能使宿主孕鼠T细胞内IL-2和IFN-γ的表达显著下降(P<0.01),IL-10的表达显著增加(P<0.01),但IL-4的表达无显著性变化(P>0.05)。与未经细胞转输的自然流产模型CBA孕鼠相比,转输非孕期CBA/J雌鼠CD4~+CD25~+T细胞的宿主孕鼠母-胎界面IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α、TGF-β的表达水平无显著性变化(P>0.05);转输正常妊娠模型CBA/J孕鼠CD4~+CD25~+T细胞或DBA/2-anergic CD4~+CD25~+T细胞的宿主孕鼠母-胎界面IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平显著增加(P<0.05);而IFN-γ和TNF-α的表达则显著下降(P<0.05)。与转输非孕期CBA/J雌鼠CD4~+CD25~+T细胞相比,转输正常妊娠模型CBA/J孕鼠CD4~+CD25~+T细胞或DBA/2-anergic CD4~+CD25~+T细胞,能够下调宿主孕鼠自身T细胞表面CD28的表达,升调节CTLA-4的表达(P<0.05)。转输DBA/2-anergic CD4~+CD25~+T细胞能显著升调宿主孕鼠母—胎界面IDO活性(P<0.05)。 结论过继转输的DBA/2-anergic CD4~+T细胞具有抑制性免疫调节功能,通过感染性耐受机制,感染宿主效应性T细胞,使其同样获得耐受细胞的典型特征,从而诱导宿主效应性T细胞对父系抗原亦产生免疫耐受,抑制母体对胚胎的免疫排斥,最终改善自然流产模型孕鼠的妊娠预后。DBA/2-anergic CD4~+CD25~+T细胞在DBA/2-anergic CD4~+T细胞诱导的母—胎免疫耐受中发挥必不可少的重要作用。 本文研究结果表明,DBA/2-anergic CD4~+T细胞具有抑制性免疫调节功能,将这种细胞过继转输至自然流产模型CBA孕鼠,能够改善其妊娠预后。转输至宿主孕鼠体内的DBA/2-anergic CD4~+T细胞能够感染宿主效应性T细胞,训导其形成对父系抗原的免疫耐受;并由此而进一步形成正常妊娠所需的免疫微环境,包括母—胎界面Th2型免疫优势、IDO的活性表达、以及协同刺激分子的生理水平表达,最终抑制宿主孕鼠对胚胎的免疫排斥。


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