收藏本站
《复旦大学》 2006年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

短小芽孢杆菌组成型高效表达分泌系统的建立与应用

孙晓波  
【摘要】: 利用天然的或经过遗传改良的微生物进行植物病虫害的防治是目前国际上较为活跃的研究领域,尤其是利用植物本身根系和叶围正常存在的微生物进行外源抗病虫害基因的转化,可使外源基因产物持续作用于植物表面,赋予植物抗病虫害的能力,避免或减少因使用化学农药对环境造成的污染。芽孢杆菌是重要的生防微生物,已有越来越多的研究表明,芽孢杆菌对植物的多种病原真菌、细菌和昆虫有抑制效果。本实验室从水稻叶片上分离出一株附生菌——短小芽孢杆菌DX01,它与水稻有良好的亲和性,经实验证明该菌具有天然拮抗某些真菌的特性,为了进一步将其定向改造成具有强抗真菌能力的工程菌,我们对该菌进行了一系列的研究工作。 采用PCR技术,亚克隆了来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)DX01菌株总基因组的启动子活性片断F1,并构建了大肠杆菌一短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-Flgfp,以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,通过荧光激活细胞分检分析,检测了启动子F1在短小芽孢杆菌DX01中的转录活性和转录阶段。结果表明启动子F1在短小芽孢杆菌DX01中有强的转录活性,是一个高效营养组成型启动子。 为了构建短小芽孢杆菌DX01的组成型表达分泌载体,以大肠杆菌β-内酰胺酶为报告蛋白,检测了枯草芽孢杆菌蛋白酶和果聚糖蔗糖酶信号肽以及短小芽孢杆菌DX01核糖核酸酶信号肽在短小芽孢杆菌DX01中驱动蛋白分泌的能力。研究结果表明这三个信号肽均能引导β-内酰胺酶从DX01细胞中分泌,但含有枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽的DX01能分泌比其他两个更多的β-内酰胺酶到细胞外;枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶和DX01核糖核酸酶的信号肽也能引导GFP从DX01细胞中分泌。 采用RT-PCR的方法,克隆了萝卜抗真菌蛋白1(Rs-AFPl)的cDNA全长,将去掉信号肽序列的Rs-afp1基因与终止密码子突变掉的绿色荧光蛋白(GFP)基因进行融合,并在其后加上T7终止子,连在枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽序列后面,构建成GFP-AFP1融合蛋白穿梭表达分泌载体pHY300-F1LgAFP1;将去掉信号肽的序列的Rs-afp1基因在其后加上T7终止子,连在枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽序列后面,构建成穿梭表达分泌载体pHY300-FILAFP1。Western杂交证实融合蛋白GFP-AFP1在短小芽孢杆菌DX01中能够表达、分泌;工程菌DX01(pHY300-F1LAFPl)的抗真菌活性增强,说明萝卜抗真菌蛋白1在 短小芽孢杆菌中能够有活性地表达和分泌。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q78

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 贾岩龙;牛杰;贾俊英;邱乐乐;薛乐勋;;杜氏盐藻GAPDH cDNA的克隆鉴定及其启动子功能表达载体的构建[J];生物技术通报;2011年07期
2 范一文;梁伟凡;李嘉胜;王海滨;范洪琼;;庆大霉素发酵液的分离提取[J];实验室研究与探索;2011年08期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 马向东;柯涛;熊兰;张桂敏;康立新;明华安;马立新;;一株产环糊精葡萄糖基转移酶的短小芽孢杆菌的选育,产酶条件及酶学特性研究[A];2006年度学术研讨会论文摘要汇编[C];2006年
2 潘皎;黄庆;张义正;;短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)碱性蛋白酶基因的克隆和表达[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
3 江正兵;马立新;;短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因的表达[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
4 张向东;杨谦;;酒精耐受性短小芽孢杆菌在硝基苯降解中的应用[A];中国化工学会2009年年会暨第三届全国石油和化工行业节能节水减排技术论坛会议论文集(上)[C];2009年
5 张丽珍;马利平;乔雄梧;郝变青;;多菌灵降解细菌对多菌灵药效的影响作用[A];2005热带亚热带微生物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集[C];2005年
6 黄庆;彭勇;张义正;;制革脱毛酶的纯化及其基因的克隆与序列分析[A];首届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2002年
7 江贤章;陈金卿;田宝玉;高媛媛;舒正玉;李欣;蓝灿华;黄建忠;;破囊壶菌△4-脂肪酸脱饱和酶基因5′端侧翼区域的克隆与鉴定[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
8 杨佑明;Yingru Wu;Danny J Llewellyn;李召虎;徐楚年;Elizabeth S Dennis;;棉花ChMyb25启动子的克隆和功能的初步分析[A];中国棉花学会2006年年会暨第七次代表大会论文汇编[C];2006年
9 曾驰;崔长征;黄玉屏;沈萍;;嗜盐古菌H.vallismortis胞外α-淀粉酶基因克隆、表达及其启动子功能的研究[A];第二届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文集[C];2006年
10 曾驰;黄玉屏;沈萍;;嗜盐古菌Haloarcula vallismortis胞外α-淀粉酶基因克隆,表达与其启动子功能的研究[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 魏公铭;酶法生产低聚木糖开发成功[N];粮油市场报;2001年
2 ;抗球虫剂——腐霉素和拉沙洛西[N];中国畜牧兽医报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙晓波;短小芽孢杆菌组成型高效表达分泌系统的建立与应用[D];复旦大学;2006年
2 陈云鹏;短小芽孢杆菌表达系统的优化研究[D];复旦大学;2004年
3 余松涛;hTERT启动子靶向性活体光学实时成像技术在肿瘤诊断及疗效评估中作用的实验研究[D];第三军医大学;2010年
4 潘皎;短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的碱性蛋白酶基因的表达研究[D];四川大学;2004年
5 岳扬波;AAV-2 P5启动子功能的分子基础研究[D];复旦大学;2009年
6 黄庆;脱毛蛋白酶的纯化及其基因的克隆与表达研究[D];四川大学;2003年
7 许正宏;微生物耐碱性木聚糖酶的合成、调控及底物降解方式的研究[D];江南大学;2005年
8 张丽珍;多菌灵降解菌的降解特性及GFP标记[D];山西大学;2007年
9 李琳玲;银杏叶黄酮积累相关基因克隆及查尔酮合成酶基因启动子功能研究[D];河北农业大学;2010年
10 王延秀;浓缩单宁合成的分子调控及紫花苜蓿遗传转化研究[D];甘肃农业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 信润海;真核启动子识别算法研究[D];辽宁师范大学;2011年
2 琦明玉;棉花种子特异性表达启动子的克隆及功能分析[D];中国农业科学院;2011年
3 蒋慧慧;几种酵母启动子的功能比较及其初步应用研究[D];江南大学;2012年
4 王菲菲;小麦储藏蛋白基因Avenin-like b启动子的克隆及表达载体构建[D];华中科技大学;2011年
5 倪娜娜;人肺癌细胞中microRNA let-7a-1/7f-1启动子的克隆及其功能的初步分析[D];山东大学;2012年
6 金莲;小麦花粉特异性基因TaPSG719启动子的功能分析[D];华中科技大学;2009年
7 于志萍;短小芽孢杆菌生物合成D-核糖及代谢通量分析的研究[D];天津科技大学;2004年
8 李陈;一种新的短小芽孢杆菌胶原蛋白酶的分离、纯化及酶学性质研究[D];四川农业大学;2008年
9 常李伟;胡杨PeWRKY1基因及其启动子的克隆与功能分析[D];北京林业大学;2011年
10 曹要玲;耐碱性木聚糖酶高产菌株的筛选、产酶条件优化及其木聚糖酶基因的克隆[D];西北农林科技大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026