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《复旦大学》 2006年
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结核分支杆菌特异的PE/PPE蛋白应用于结核病血清学诊断的初步研究

张红梅  
【摘要】:结核病是一种主要的呼吸系统传染病。早期诊断以及规范的多药物联合的化学治疗是主要的控制策略。改良的诊断试剂对于检测结核分支杆菌感染是必须的,研究新的血清学诊断方法是对现有诊断方法的一个有力补充。 最近已经证明由结核分支杆菌RD1(一个9.5-Kb的DNA片段)区基因编码的蛋白在细菌毒力、疫苗发展和诊断试剂设计等方面具有重要作用。比较基因组学和生物信息学表明除了RD1,还有11个基因组区域在M.tuberculosis中保守存在,而在BCG疫苗株中是缺失的。这些缺失区包括了M.tuberculosis H37Rv 108个ORFs,在目前世界不同地区用作抗结核疫苗的所有13个BCG疫苗亚株中都是缺失的。最近已经有不少研究证明,RD1区和其他的RD区编码的蛋白具有发展成为疫苗和诊断试剂的潜力。M.tuberculosis基因组中大约有10%的ORFs编码了PE和PPE家族蛋白,它们是富含甘氨酸且M.tuberculosis特有的蛋白,由于PE/PPE家族蛋白在序列和可能结构上的独特性,推测它们有可能具有比较重要的免疫学意义,这方面的研究目前还不是太多。不过,现在已经有了一些关于在临床方面定性定量研究PE/PPE蛋白的免疫反应的报道。 本项研究的目的是为了确认新的结核病血清学诊断抗原,我们拟对在M.tuberculosis中保守存在,而在BCG中缺失的PE/PPE家族成员-Rv3425,Rv3426,Rv3429,Rv2352c,Rv2353c,Rv3621c和Rv3622c的免疫学特性进行评估,并且将它们与人们熟知的两个抗原,ESAT-6和CFP-10相比较。以体外培养的M.tuberculosis H37Rv提取的RNA为模板的RT-PCR实验证明在转录水平上可以表达的基因有Rv3425,Rv3426,Rv3429,Rv2353c,这也预示着它们有可能是在体外指数生长期表达的功能活跃的基因。我们成功地在E.coli中克隆表达纯化了重组蛋白Rv3425,Rv3429,Rv2353c,CFP-10和ESAT-6。并用这些抗原来检测针对结核病人血清以及接种BCG的健康对照者(n=28)血清的抗体反应。结核病人血清包括肺结核病人的血清(n=50)和肺外结核病人的血清(n=32)。 我们检测了三个PPE重组蛋白,Rv3425,Rv3429,Rv2353c和两个对照抗原CFP-10,ESAT-6在识别结核病人和健康对照者血清中IgG抗体的反应。五种抗原检测肺结核病人血清IgG反应的敏感性分别为70.0%,22.0%,16.0%,78.0%和36.0%,检测肺外结核病人中的血清IgG反应的敏感性分别为59.4%,18.8%,12.5%,65.6%和34.4%,与接种过BCG疫苗的健康对照者相比较,五种抗原检测结核病人的特异性分别为100%,96.4%,96.4%,96.4%和100%。可以看出,虽然五种抗原的特异性均比较高,可是在检测结核病人的敏感性方面,也只有重组Rv3425蛋白抗原与CFP-10(Rv3874)相当。如果我们将重组蛋白Rv3425,CFP-10 和ESAT-6的血清学检测结果合并在一起考虑,检测肺结核和肺外结核病人的敏感性分别可以上升到82%和68.8%,特异性为96.4%。 我们还检测了重组蛋白Rv3425,CFP-10和ESAT-6的IgM抗体反应,检测肺结核和肺外结核病人的敏感性分别为32.0%,74.0%,78.0%和29.0%,64.5%,61.3%,特异性分别为100%,96.4%,96.4%。如果将三个抗原的检测结果合并在一起考虑,检测肺结核和肺外结核病人的敏感性分别可以上升到88%和68.8%,特异性为96.4%。 从研究中我们可以发现,重组Rv3425、CFP-10和ESAT-6蛋白针对接种BCG的健康对照者和结核病人的血清学反应具有显著的差异(p<0.0001),而且我们还发现重组Rv3425蛋白抗IgG的抗体反应强度基本上同CFP-10等同,并且高于ESAT-6。证明了M.tuberculosis Rv3425具有免疫敏感性和免疫特异性的本质,有希望用于结核病人的血清学诊断,这在以前是没有报道过的。 总之,利用现有的血清学诊断测试检测出所有结核病人血清中抗原物质的所有抗体是不可能的,但是合并这些单独的抗原将会增加血清学诊断的作用。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R52;R378

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