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不同吸氧方式在新生小鼠视网膜病变发病中的作用

王玉环  
【摘要】: 第一部分不同日龄新生小鼠视网膜血管对氧疗的敏感性 目的:给不同日龄新生小鼠吸氧,观察日龄对氧疗的敏感性,研究视网膜血管的发育程度与新生血管形成的关系。 方法:选择4、7、9、11日龄C57BL/6J新生小鼠各48只,分别分为高氧组和空气组,高氧组给予吸入75%氧气5天后返回到空气中,空气组置于同实验条件下的空气中。通过视网膜铺片和视网膜切片定性和定量的研究,观察视网膜血管的变化。视网膜铺片经ADP酶染色,观察视网膜血管形态的改变;视网膜切片经常规HE染色,计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数目,定量观察视网膜血管的增生情况。 结果:与各空气组相比,4、7、9日龄高氧组小鼠吸高氧5天后(出氧箱当天),视网膜铺片显示血管明显收缩、阻塞,视网膜中央大片无灌注区;返回空气第2天,新生血管开始形成;第5天,新生血管形成达到高峰。而11日龄高氧组小鼠在返回空气第5天未见新生血管形成。4、7、9、11日龄高氧组小鼠出氧箱第5天突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目分别为25.0±3.7、47.7±5.0、18.7±2.0、2.6±1.4个,4、7、9、11日龄空气组分别为0.7±1.1、1.2±1.2、0.8±1.0、1.6±1.0个,4、7、9日龄高氧组细胞核数目明显增多,与相应的空气组比较,差异有显著意义(P<0.01);11日龄高氧组细胞核数无明显增多,与11日龄空气组比较,差异无显著意义(P=0.07)。7日龄高氧组细胞核数目最多,与4、9、11同龄高氧组比较差异有显著意义(P<0.01)。 结论:4、7、9日龄C57BL/6J新生小鼠视网膜血管对氧疗敏感,吸75%氧5天后发生了类似人类ROP的视网膜病变,其中7目龄新生小鼠病变最严重,是制备ROP的最理想动物模型。11日龄新生小鼠吸75%氧5天后未发生视网膜病变。视网膜血管的发育程度与新生血管形成有关,视网膜血管发育越不成熟越易发生视网膜病变,而发育成熟的视网膜则不会发生视网膜病变。 第二部分不同吸氧方式对新生小鼠视网膜血管发育的影响及在视网膜病变发病中的作用 目的:研究不同吸氧方式对新生小鼠视网膜血管发育的影响及在视网膜病变发病中的作用,为早产儿临床合理用氧提供实验依据。 方法:选择7日龄C57BL/6J新生小鼠720只,随机分为6组,每组120只。具体分组如下:缓升骤停组:FiO_2由30%逐渐升高至75%后突然中断吸氧;暂高缓停组:吸75%氧1天,然后逐渐降低FiO_2直至停氧;高氧骤停组:吸75%高氧5天后骤然停氧;高氧缓停组:吸75%高氧5天后逐渐降低FiO_2直至停氧;高氧波动组:FiO_2波动较大,隔天吸75%高氧和空气共6天;对照组:置于同实验条件下的空气中。观察各组视网膜血管改变:视网膜铺片经ADP酶染色,观察视网膜血管形态的动态改变;视网膜切片经常规HE染色,计数每只小鼠每张切片上突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数目,定量观察视网膜血管的增生情况。各组P7—P21隔天剥离视网膜,采用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠视网膜VEGF、PEDF和IGF-1 mRNA表达水平,各组P7—P21隔天取小鼠摘取眼球,制备切片,采用免疫组化法检测各组小鼠视网膜VEGF、PEDF蛋白水平的变化。 结果:1.视网膜铺片:对照组,P12见少量无灌注区,周边血管结构清晰,P14无灌注区消失,血管形态基本正常,P17血管形态全部正常。缓升骤停组、高氧骤停组、高氧波动组,P12视网膜中央部有大片无灌注区,血管收缩、闭塞,P14新生血管开始形成,P17大量新生血管形成。高氧缓停组,P14视网膜中央部大片无灌注区,有少量新生血管形成,P17无灌注区缩小,血管走行基本正常,深层血管有阻塞,P22血管发育基本正常。暂高缓停组铺片显示视网膜血管形态与对照组相似。2.视网膜切片:缓升骤停组、暂高缓停组、高氧骤停组、高氧缓停组、高氧波动组小鼠突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核的数目分别为49.5±1.4、5.2±0.7、47.7±4.7、5.7±2.4、29.2±2.5个,对照组为1.2±0.2个,缓升骤停组、高氧骤停组、高氧波动组细胞核数明显增多,与对照组比较差异有显著意义(P=0.000);暂高缓停组、高氧缓停组细胞核数无明显增多,与对照组比较差异无显著意义(P值分别为0.226和0.442)。各实验组之间相互比较,缓升骤停组、高氧骤停组细胞核数目明显增多,分别与暂高缓停组和高氧缓停组比较,差异有显著意义(P<0.05)。3.视网膜VEGF的改变:对照组新生小鼠VEGF mRNA于P7上升,P11达高峰,此后下降,P13降至最低水平,并始终维持低水平。缓升骤停组、高氧骤停组、高氧波动组VEGF mRNA P7开始下降,在整个吸氧期持续降低,P11降至最低水平,至出氧箱后缓慢上升,P15显著上升,与对照组比较差异有显著意义,受氧浓度的调节非常明显。暂高缓停组VEGF mRNA变化趋势与对照组一致。高氧缓停组VEGF mRNA P9显著下降,在整个高氧阶段持续降低,P11降至最低水平,随着氧浓度的降低,P13稍有上升,但与对照组相比差异无显著意义。VEGF蛋白水平变化趋势与mRNA水平一致。4.视网膜PEDF的改变:对照组新生小鼠PEDF mRNA P7逐渐上升,P13升至最高水平,此后稍有下降,但仍在较高水平。缓升骤停组、高氧骤停组、高氧波动组PEDF mRNA P7逐渐上升,三组分别于P13、P11、P11升至最高水平,出氧箱后逐渐下降,P15显著下降,与对照组比较差异有显著意义,受氧浓度调节明显。暂高缓停组PEDF mRNA变化趋势与对照组一致。高氧缓停组PEDF mRNA P9显著上升,P11升至最高水平,随着氧浓度的降低,无显著下降。PEDF蛋白水平的变化趋势与mRNA水平一致。5.视网膜IGF-1的变化:对照组新生小鼠IGF-1 mRNA P7逐渐下降,P15显著下降,为P7的0.8,并维持此水平至P21。缓升骤停组、高氧骤停组、高氧波动组IGF-1 mRNA于P7逐渐下降,P11降至最低水平,P13明显上升,三组分别于P15、P17、P17升至最高峰,与对照组比较差异有显著意义,此后逐渐下降,P21降至较低水平。暂高缓停组IGF-1 mRNA P7逐渐下降,P21降至最低,为P7的0.8,各时间点与对照组相比差异无显著意义。高氧缓停组IGF-1 mRNA P7逐渐下降,P11降至最低值,P15升至最高水平,与对照组比较差异有显著意义,此后逐渐下降,P21降至最低值。 结论:1.不同吸氧方式对视网膜血管发育产生不同的影响,吸入氧浓度波动较大、吸入高浓度氧后突然停氧可严重影响新生小鼠视网膜血管的发育,形成新生血管,产生类似早产儿视网膜病的病变。因此临床上应尽早稳定早产儿的生命体征,减少氧疗,严密监测用氧情况,采取逐渐降低氧浓度的吸氧方式,并尽量避免氧浓度波动过大。2.VEGF、PEDF和IGF-1共同参与新生血管形成的调节,VEGF促进新生血管形成,而PEDF抑制新生血管形成。高氧下调VEGF表达,上调PEDF表达,使VEGF/PEDF比值下降;而低氧则正好相反,使VEGF/PEDF比值上升,促进新生血管形成。IGF-1对维持正常视网膜血管发育起重要作用,并与VEGF共同促进新生血管形成。 第三部分补氧对新生小鼠视网膜病变新生血管的影响 目的:对已发生视网膜病变的新生小鼠继续使用不同浓度的氧气,观察视网膜血管的变化,为临床上已发生ROP病变患儿的氧疗提供实验依据。 方法:7日龄C57BL/6J新生小鼠210只,根据不同的补氧方案将新生小鼠分为8组。非补氧组:小鼠吸75%高氧5d,出氧箱后返回到空气中;30%、50%、75%补氧组:小鼠吸75%高氧5d后,再分别吸入30%、50%、75%O_2各5天;间断30%、50%、75%补氧组:小鼠吸75%高氧5d后停氧2d,再分别吸入30%、50%、75%O_2各5天;对照组置于同实验条件下的空气中。观察各组视网膜血管改变:视网膜铺片经ADP酶染色,观察视网膜血管形态的动态改变;视网膜切片经常规HE染色,计数每只小鼠每张切片上突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数目,定量观察视网膜血管的增生情况。 结果:1.视网膜铺片:对照组,P12见少量无灌注区,周边血管结构清晰,P14无灌注区消失,血管形态基本正常,P17起血管形态全部正常。非补氧组,P12视网膜中央部有大片无灌注区,血管收缩、闭塞,P14新生血管开始形成,P17大量新生血管形成。30%补氧组,P17见大片无灌注区,开始出现新生血管,P19、P22有大量新生血管形成。50%、75%补氧组,P17见少量无灌注区,血管分支少,走行僵直,P19无灌注区消失,大血管管径、分支、走行均基本正常,仅见深层血管有阻塞现象,P22血管发育基本成熟,可见两层血管网结构。间断30%补氧组,P19少量新生血管,P21、P24血管网结构紊乱,大量新生血管形成。间断50%、75%补氧组,P19见少量无灌注区,血管分支、管径、走行基本正常,深层血管有阻塞现象,P21无灌注区消失,血管发育基本成熟,P24血管发育完全成熟,两层血管网结构清晰。2.视网膜切片:非补氧组,30%、50%、75%补氧组,间断30%、50%、75%补氧组小鼠突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核分别为47.7±5.2、24.9±4.0、2.6±1.5、3.8±2.2、31.1±4.8、2.0±1.5、8.9±3.1个,对照组为1.2±1.1个。非补氧组、30%、间断30%补氧组细胞核数目明显增多,与对照组比较差异有显著意义(P<0.05);50%、75%补氧组、间断50%、75%补氧组细胞核数目无明显增多,与对照组比较差异无显著意义(P值分别为0.688,0.446,0.809,0.24)。各实验组之间相互比较,非补氧组细胞核数目最多,与50%、75%补氧组、间断50%、75%补氧组比较差异有显著意义(P<0.05);与30%补氧组、间断30%补氧组比较差异无显著意义(P值分别为0.07,0.058)。 结论:1.在ROP形成第一阶段后即第二阶段初始给予适当吸氧可抑制新生血管形成,减轻视网膜病变,但这是很有争议的问题,在临床上如何掌握具体补氧方法,有待于进一步研究。2.吸入高氧后骤然停氧会促进视网膜新生血管形成,在临床工作中吸入高氧后应逐渐减低吸入氧浓度,尽量避免氧浓度尤其血氧分压的过度波动。


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