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《复旦大学》 2005年
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叶酸及其部分代谢因素对人类基因组稳定性的作用机制研究

汪旭  
【摘要】: 叶酸(folate,FL)是DNA代谢活动所必需的一种微量营养素(micronutrient),人体不能合成,需从食物中获取。FL包括众多衍生物,药物和强化食品中所添加的叶酸为FL的合成形式——folic acid(FA)。叶酸代谢涉及DNA合成和DNA甲基化二个重要生化过程,因此与DNA复制、损伤修复、基因表达和细胞增殖等过程紧密相关;叶酸代谢需要多种酶和辅助因子参与,其中亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的催化作用对DNA甲基化过程或DNA合成之间的分支走向发挥着关键作用,核黄素(riboflavin,RF)作为MTHFR的重要辅助成分,亦存在影响叶酸代谢的可能性。 本论文旨在探讨叶酸、核黄素、MTHFR基因型多态性等叶酸代谢因素对人类基因组稳定性的作用及其机制,初步界定以维护基因组稳定性为目标的叶酸、核黄素推荐日摄取量(Recommended Dietary Allowances,RDA)。研究采用放射免疫法、胞质分裂阻断微核分析(CBMN)、荧光原位杂交(FISH)、多重PCR-RFLP(Multiplex PCR-RFLP)等技术,比较分析了正常女性与乳腺癌患者血浆/红细胞叶酸浓度、正常女性和乳腺癌患者淋巴细胞基因组对叶酸缺乏的敏感性差异,解析了差异形成的可能机制;研究了不同氧化形式叶酸FA和5-亚甲基四氢叶酸(MeTHF)对人类基因组稳定性与17、21号染色体分离的作用差异;探讨了非癌正常对照与乳腺癌患者MTHFR C677T、A1298C多态性分布、FA--RF不同浓度组合对各种MTHFR基因型个体基因组稳定性的作用与机制。 研究发现:(1)乳腺癌患者血浆和红细胞总叶酸浓度均显著低于对照(P<0.001),提示人体叶酸状况与乳腺癌危险度有一定关联;(2)离体条件下,FA为30nM时,病例及对照淋巴细胞主要遗传损伤标志(微核化双核细胞,MNed BNC;核质桥,NPB;核芽,BUD)均显著高于120nM和240nM FA组(P<0.001),但120nM和240nM FA组间无显著差异,因此,120nM FA在本试验系统下是维护基因组稳定性的最适浓度;(3)乳腺癌患者的遗传损伤程度和细胞毒性水平均高于对照((P≤0.005),但以Difference of Difference Analysis(DDA)排除二组样本之间的遗传损伤基线(baseline)差异后,发现他们对FA缺乏的遗传损伤和细胞死亡敏感性无显著差异,提示高遗传损伤基线和叶酸缺乏引起的遗传不稳定均构成乳腺癌的危险因素;FA对MNed BNC、NPB、BUD、APO(细胞凋亡)及NEC(细胞坏死)的变异贡献分别为60%、39%、39%、52%和71%,而样本(肿瘤状态)状况对MNed BNC和NEC变异贡献仅6%和7%,提示叶酸对基因组稳定性和细胞死亡的作用显著高于肿瘤状况;(4)FA和MeTHF这二种形式的叶酸在120nM时均显著降低其相同形式的12nM组MNed BNC频率(P<0.05),二种形式叶酸缺乏诱发非整倍体也表现同样的趋势,高浓度叶酸组17和21号染色体非整倍体频率分别比低浓度降低26%和35%,但MeTHF消弱遗传损伤的能力显著低于FA。结果证实了叶酸维护基因组稳定性的重要作用,但不支持MeTHF防范遗传损伤能力更强的假设;(5)MTHFR C677T和A1298C多态基因型分布在对照与乳腺癌患者间未出现显著性差异;(6)低FA-低RF培养基组合使对照与病例的遗传损伤率均达最高水平,而高FA-低RF组合使遗传损伤水平降至最低;在C677T多态性个体中,高FA条件使对照MNed BNC、BUD、NPB频率分别降低43%、48%、44%,病例组降低35%、45%和34%;而高RF条件下相应遗传损伤仅降低3~10%。在A1298C多态性个体中,高FA使对照MNed BNC、BUD、NPB频率分别降低42%、55%和36%,病例组降低37%、45%和36%;高RF使对照BUD和NPB水平降低11%和18%,病例组中NPB降低11%。结果有力地证明了FA维护基因组稳定性的效率显著高于RF;(7)MTHFR野生型纯合子677CC、1298AA基因组稳定性高于突变纯合子677TT和1298CC;(8)677CC、1298AA乳腺癌个体基因组稳定性显著低于相同基因型的对照,但DDA分析却揭示他们对FA、RF缺乏的遗传损伤敏感性无显著差异,因此,乳腺癌患者基因组稳定性除受FA、RF和MTHFR多态性的影响外,还受到其他内源因素的作用。 本研究从营养基因组学的角度探讨FA、RF和MTHFR多态性对正常人/乳腺癌患者基因组稳定性的作用与机制,证实了120nM FA为离体条件下维护淋巴细胞基因组稳定性的最适浓度,尽管其未精确反映活体对叶酸的需求情形,但为“基因组健康”所需要的最适叶酸剂量提出了有价值的参考范围。RF和MTHFR多态性对基因组稳定性的作用不及FA。研究证实对照与乳腺癌患者淋巴细胞对FA、RF缺乏的遗传敏感性无显著差异,即它们在二组样本间维护遗传稳定性的效率无显著差异。但叶酸长期缺乏可增加遗传损伤,进一步提高易感人群的遗传不稳定性,成为乳腺癌风险因素之一。适量提高叶酸摄取有利于减少个体遗传损伤,间接降低乳腺癌的危险度。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q987

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