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《复旦大学》 2007年
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2型糖尿病大鼠心肌微血管内皮细胞血管新生功能障碍的体外研究

王新红  
【摘要】: 血管内皮细胞不仅是血管内的一层屏障,还具有活跃的合成细胞因子和各种活性物质参与机体多种生理功能调节的重要作用。因此,内皮细胞功能障碍一直是2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)血管病变的重点研究领域。动物实验和临床病例回顾性研究已经表明,心肌微血管密度降低,侧枝循环形成减少等血管新生障碍的表现是2型糖尿病性心血管病变的主要病理改变。高血糖是一种公认的糖尿病微血管并发症的危险因素,然而许多血糖控制较好的T2DM患者也存在微血管病变的发生,这表明除高血糖外,尚有其他因素参与微血管病变的发生。众多研究者已经注意到T2DM患者常同时伴有高游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)血症,并且FFA水平升高在T2DM内皮细胞功能障碍的机制中发挥重要作用。T2DM的代谢紊乱(高血糖,脂质代谢紊乱等)之间可能存在复杂的交互作用,促成了糖尿病微血管病变的发生、发展。 本研究采用国际上公认的自发性非肥胖型T2DM GK大鼠(Goto-Kakizaki rat,GK rat)作为模型,分别分离心肌微血管内皮细胞(myocardial microvascular endothelial cells,MMVEC)和主动脉大血管内皮细胞(aortic endothelial cell,AEC)进行培养,在体外比较微血管和大血管内皮细胞血管新生功能的改变。已有研究结果表明,促血管新生因子以及受体的异常表达和信号转导障碍是糖尿病血管新生异常的重要原因。根据促血管新生因子和抑制因子平衡的理论,我们在实验中从促血管新生因子的角度出发,以正常Wistar大鼠作为对照,比较GK大鼠来源的心肌微血管内皮细胞及主动脉大血管内皮细胞上促血管新生因子和受体的表达变化,并进一步研究microRNAs在基因表达调控中的可能作用。实验主要分以下四部分: 第一部分:取8~9周龄GK大鼠,测定其餐后以及空腹血糖均高于同龄的对照Wistar大鼠,达到T2DM的诊断标准后用作细胞原代培养的取材动物。利用心肌植块法和主动脉环种植法培养大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVEC)和主动脉内皮细胞(AEC)。从活体细胞形态、AcLDL吞噬功能及表面分子标志来看,来源于GK大鼠的MMVEC和AEC与正常Wistar大鼠来源的MMVEC及AEC并没有明显区别。分别用增殖、迁移、黏附和毛细血管管腔样结构形成实验来观察体外MMVEC和AEC的血管新生能力的改变。结果发现,来源于GK大鼠的MMVEC(GK-MMVEC)与来源于正常Wistar大鼠的MMVEC(Wis-MMVEC)相比,其体外增殖、迁移、黏附和毛细血管管腔样结构形成能力均明显降低(P<0.05),而来源于GK大鼠的大血管内皮细胞AEC(GK-AEC)与来源于正常Wistar大鼠AEC(Wis-AEC)比较,上述功能均没有明显异常。以上结果表明,同一个糖尿病GK大鼠,其心肌微血管内皮细胞出现血管新生功能的障碍可能要早于大血管内皮细胞,这说明由于大小血管来源的内皮细胞的差异,对于T2DM引起的某些器官血管病变的研究不能一概从大血管来源的内皮细胞中进行。 第二部分:为了进一步分析GK-MMVEC和GK-AEC为何出现体外血管新生能力的不同,我们采用了大鼠血管新生特异系列基因芯片观察促血管新生因子和受体表达谱的改变。结果发现,GK-AEC的大部分促血管新生因子和受体基因无明显表达变化,而GK-MMVEC的促血管新生因子和受体基因表达有明显升高。在血管新生基因芯片的基础上,重点针对GK-MMVEC上VEGF及其受体Flt-1、Flk-1的表达做了进一步的研究。Real-time RT-PCR结果发现,VEGF及其受体Flt-1、Flk-1的mRNA表达水平有明显升高,其中VEGF是正常对照Wistar大鼠的2.14±0.68倍,Flt-1为3.48±0.85倍,而Flk-1mRNA的表达升高最为明显,为正常水平的6.35±1.44倍(P<0.01)。GK-AEC上VEGF及其受体Flt-1、Flk-1的表达并没有变化。上述结果与血管新生基因芯片结果一致。Western-Blot结果发现,GK-MMVEC上VEGF及其受体Flt-1、Flk-1蛋白的表达水平明显降低,而GK-AEC上VEGF及其受体Flt-1、Flk-1蛋白的表达仍没有变化。ELISA方法发现GK-MMVEC分泌的VEGF量也有明显降低。实验结果表明,GK-MMVEC上VEGF及其受体Flt-1、Flk-1mRNA水平表达明显上调,但蛋白水平表达却存在明显的抑制现象。我们认为,这种mRNA表达与蛋白表达分离的现象是GK-MMVEC血管新生障碍的重要原因之一,这可能和基因的转录后调节障碍有关。mRNA表达上调可能是细胞对蛋白水平降低的一种代偿反应。 第三部分:通过体外培养大鼠心肌微血管内皮细胞,观察高血糖,高FFA单独存在及这两者共存时对MMVEC的血管新生能力的影响。探讨游离脂肪酸和高血糖对VEGF及受体表达的作用。利用实时定量RT-PCR、Western blot方法观察葡萄糖、游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)及二者联合对MMVEC中VEGF、Flt-1、Flk-1 mRNA及蛋白表达的调节。结果显示以上因素对MMVEC中VEGF、Flt-1、Flk-1 mRNA及蛋白的影响存在明显的时间和剂量相关性。mRNA结果显示:终浓度为33.3mmol/L的D-葡萄糖作用MMVEC 4小时后,VEGF mRNA达最高水平,而Flt-1、Flk-1 mRNA降至最低点(与对照组相比,P<0.01),之后逐渐恢复,但变化持续至24小时,仍未恢复到正常水平;终浓度为(PA0.125mmol/L+OA 0.25mmol/L)的FFA作用MMVEC后,VEGF和Flk-1 mRNA在4h降到最低点,而Flt-1mRNA在12小时降到最低点(与对照组相比,P<0.01);高糖联合游离脂肪酸(D-glucose33.3mmol/L+PA 0.125mmol/L+OA 0.25mmol/L)作用于MMVEC,VEGF、Flt-1、Flk-1mRNA分别在12h、2h、8h、降到最低点,(与对照组相比,P<0.01)。在剂量依赖实验中,葡萄糖、游离脂肪酸作用最强浓度分别为33.3mmol/L和PA 0.25mmol/L+OA 0.5mmol/L(与对照组相比,P<0.01)。蛋白检测结果显示:33.3mmol/L的D-葡萄糖作用8小时后,VEGF蛋白达最高水平,Flt-1、Flk-1蛋白在24小时降至最低(与对照组相比,P<0.01);而加入(PA 0.125mmol/L+OA 0.25mmol/L)的FFA时,VEGF、Flk-1、Flk-1蛋白分别在24h、8h、24h降至最低(与对照组相比,P<0.01)。高糖联合游离脂肪酸(D-glucose33.3mmol/L+PA 0.125mmol/L+OA 0.25mmol/L)作用于MMVEC,VEGF、Flt-1、Flk-1蛋白分别在24h、12h、24h降到最低点,(与对照组相比,P<0.01)。在剂量依赖实验中,葡萄糖、游离脂肪酸对蛋白表达作用最强浓度同样为33.3mmol/L和PA 0.25mmol/L+OA 0.5mmol/L(与对照组相比,P<0.01)。在研究上述因素对体外血管新生的影响的实验中,结果发现高葡萄糖33.3 mmol/L培养16小时,对MMVEC的迁移能力,黏附能力以及毛细血管管腔样结构形成的数量均没有显著影响(P>0.05),而游离脂肪酸组(PA0.125mmol/L+OA 0.25mmol/L)明显抑制MMVEC的迁移能力,黏附能力以及毛细血管管腔样结构形成(P<0.05),高糖联合游离脂肪酸组除了这三种指标均低于对照组以外,与单纯高游离脂肪酸组相比,MMVEC跨膜迁移数,黏附能力都明显减少(P<0.05),而且几乎没有完整的毛细血管管腔样结构的形成。以上结果表明,短期内的高糖虽然可以抑制受体Flt-1,Flk-1的表达,但由于对配体VEGF存在上调作用,因此对MMVEC血管新生能力并没有明显的影响。而FFA的作用在短期内就可以抑制VEGF及受体Flt-1,Flk-1的表达,因而对血管新生存在明显的抑制作用。短期内的高糖可能是FFA抑制MMVEC血管新生的一个协同因素。 第四部分:为了进一步探讨GK-MMVEC血管新生障碍的机制,本部分首先利用microRNAs芯片研究GK-MMVEC microRNAs表达谱的改变。发现表达量上调2倍的miRNAs分子共11种,包括let-7e,miR-129,miR-291-5p,miR-320,miR-327,mir-333,miR-363-5p,miR-370,miR-494,miR-503,miR-664。通过检索预测miRNAs靶基因的TargetScan,miRanda,PicTar,TargetScanS四个常用数据库。发现11种表达上调的miRNAs中有9种存在与血管新生密切相关的靶基因,包括VEGF及受体Flk-1,IGF-1及受体IGF-1R等。并对预测靶基因数量最多的miR-320用microRNA实时定量PCR的方法进行了验证。miR-320的预测靶基因中包括Flk-1,IGF-1及IGF-1R,我们进一步用实时PCR和Western Blot的方法研究了GK-MMVEC上IGF-1及IGF-1RmRNA和蛋白的表达差异。结果发现,IGF-1 mRNA明显高于Wis-MMVEC,IGF-1RmRNA与Wis-MMVEC没有差异,而二者的蛋白表达水平均明显低于Wis-MMVEC,结果符合miRNAs调控基因的表达方式。因此,我们认为IGF-1及IGF-1R的蛋白表达在其mRNA表达没有降低的情况下出现明显的降低很可能是由miR-320的异常表达升高引起的,并且认为这些异常升高的miRNAs同GK-MMVEC的血管新生障碍存在密切关系。 综上所述,本研究结果提示:同一个GK大鼠,其心肌微血管内皮细胞出现血管新生功能的障碍可能要早于大血管内皮细胞;GK-MMVEC上VEGF及其受体Flt-1、Flk-1mRNA水平表达明显上调,但蛋白水平表达却存在明显的抑制现象。我们认为,这种mRNA表达与蛋白表达分离的现象是GK-MMVEC血管新生障碍的重要原因之一;异常表达的miRNA—320对IGF-1和IGF-1R的基因转录后抑制同GK-MMVEC的血管新生障碍存在密切关系。葡萄糖和FFA可以时间和剂量依赖的方式影响VEGF以及Flt-1,Flk-1的表达,短期内的高糖对MMVEC血管新生能力的影响不显著。而FFA短期内就对血管新生存在明显的抑制作用。短期内的高糖可能是FFA抑制MMVEC血管新生的一个协同因素。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R587.1

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