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《复旦大学》 2007年
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新型重组双功能葡激酶(RGD-SAK)的中试和临床前研究

陈宏山  
【摘要】: 心肌梗死是一种严重威胁人类生命健康的疾病,溶栓治疗是临床急救心肌梗死的一种常用手段。葡激酶(Staphylokinase,SAK)具有与组织型纤溶酶原激活剂(Recombinant tissue-type plasminogen activator,t-PA)相当的溶栓活性,并有更高的纤维蛋白专一性,能以大肠杆菌为宿主大量制备,是一种很有应用前景的溶栓剂。但SAK仍存在着再通不完全、初始再灌注延迟、血栓再形成、出血和过敏反应等缺陷,限制了临床使用。血小板聚集在动脉血栓形成中起重要作用,而血小板聚集依赖于特有的功能性受体GPⅡb/Ⅲa,Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列能特异性结合GPⅡb/Ⅲa,从而抑制血小板聚集。因此,本实验室利用定点突变PCR技术,将SAK第35位赖氨酸(K)置换为精氨酸(R),设计了新型SAK突变体RGD-SAK,通过5L发酵罐小试发酵、纯化得到重组RGD-SAK纯品蛋白,初步生物学试验证实其具有溶栓和抑制血小板聚集的双重功能。 在上述研究基础上,本课题进行了RGD-SAK的中试和临床前研究。包括建立300L发酵罐RGD-SAK工程菌大规模发酵和表达产物纯化工艺,并完成中试产品的质量检定和质量控制,为临床前研究提供足量样品;根据国家生物制品规程制定制造和检定规程;体外检测RGD-SAK功能;开展临床前药效学研究,包括:RGD-SAK溶栓、防栓及预防再狭窄等功效;研究RGD-SAK的药代动力学特征并进行安全性评价,为临床试验奠定基础。 中试阶段利用300L发酵罐进行大规模发酵,42℃诱导基因表达,诱导后0.5小时开始胞内可溶性表达活性RGD-SAK,2.5小时达到表达高峰,表达产物约占菌体总蛋白的60%。高压破菌后胞液通过阳离子交换层析柱(SP-Sepharose),凝胶过滤层析柱(Sephadex G-50)和阴离子交换层析柱(Q-Sepharose)后,得到高纯度的产品。RP-HPLC分析纯度>98%,LC-MS分析产品分子量为15,478D,每升发酵液得RGD-SAK纯品300mg,纯化得率达60%。进一步的质量检定表明各项检测指标均符合国家生物制品检定标准。 RGD-SAK N端序列及一级结构序列测定结果和原设计一致,其溶栓比活性为12,000IU/mg,体外对激活血小板有较高的结合力(P<0.05),并呈量效关系,而SAK无此功能,相对于SAK,RGD-SAK体外溶解血小板血栓所需时间明显缩短(P<0.05)。RGD-SAK体外能抑制血小板聚集且呈量效关系,SAK无此功能。上述结果提示RGD-SAK在体内可能通过靶向结合血小板提高溶栓效率,并通过抑制血小板聚集而降低溶栓后再栓。 利用球囊损伤形成血栓模型,开展了RGD-SAK溶栓及溶栓后预防再栓的药效学研究,利用DSA(digital substrate angiography)造影观察冠状动脉损伤前、血栓形成时、溶栓90分钟、24小时及30天血管通畅情况,并进行血液学分析,结果显示,RGD-SAK 50,000 IU/kg较等剂量SAK有更高的90分钟溶栓开通率(P<0.05),RGD-SAK 30,000 IU/kg 90分钟溶栓率不低于SAK50,000 IU/kg组(P>0.05),同时,溶栓后30天DSA造影结果显示,RGD-SAK30,000及50,000 IU/kg组中均未发现再梗塞,而SAK 50,000 IU/kg组中6只溶栓再通的猪中有4只发生再梗塞(P<0.05)。检测血液中反应溶栓指标D-dimer和cTnT(心肌钙结合蛋白T,cardiac troponin T)发现,RGD-SAK50,000 IU/kg溶栓后90分钟及24小时后两者均高于SAK 50,000 IU/kg组;检测和动脉血栓形成相关指标血小板聚集率发现,各剂量RGD-SAK组均明显拮抗血小板聚集(P<0.05),而SAK 50,000 IU/kg拮抗血小板聚集作用不明显;检测血液中凝血酶原时间(Prothrombin Time,PT),活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT、,凝血酶时间(Thrombin Time,TT)及纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)的水平发现,各组上述指标在观察时间内均无显著变化,这表明在实验浓度范围中RGD-SAK和SAK对系统凝血和纤溶系统无明显影响(P>0.05)。上述结果表明,该模型中50,000 IU/kg RGD-SAK较等量SAK具有更高的溶栓效率,并可以预防溶栓后再栓,同时不影响系统的凝血和纤溶功能。 再狭窄是经皮冠状动脉腔内血管成形术(Percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)的常见并发症,为探索RGD-SAK是否具有预防再狭窄的功效,利用球囊损伤猪冠状动脉建立了再狭窄模型,病理切片观察损伤30天后冠状动脉内膜增生程度,并检测试验血管组织中超氧阴离子(·O~(2-))浓度和NADPH氧化酶的活性,western blot分析NADPH氧化酶亚基p22~(phox)和gp91~(phox)的表达情况,同时检测血液中血小板诱导生长因子-BB(Platelet derived growth factor,PDGF-BB)浓度,结果表明,球囊损伤30天后,损伤部位明显出现内膜增生形成再狭窄,增生细胞主要为平滑肌细胞,相对于SAK50,000 IU/kg,等剂量RGD-SAK能明显抑制损伤后内膜增生(P<0.05),并能减少血液中PDGF-BB的释放,同时能明显抑制NADPH氧化酶依赖性的·O~(2-)浓度增高(P<0.05),进一步试验表明RGD-SAK 50,000 IU/kg组能够显著抑制损伤引起的NADPH氧化酶亚基p22~(phox)和gp91~(phox)表达增加,上述结果说明RGD-SAK可能通过抑制血小板聚集、活化减少PDGF-BB的释放,从而抑制损伤引起的NADPH氧化酶亚基p22~(phox) and gp91~(phox)的高表达,降低血管产生·O~(2-),有利于预防血管损伤后再狭窄的产生。 采用~(125)I放射性示踪技术,对RGD-SAK在SD大鼠体内进行药代动力学研究发现,低(0.5m/kg)、中(1mg/kg)、高(2mg/kg)三种剂量RGD-SAK的t_(1/2(β))分别为51.77±11.78min、55.03±8.64min及54.82±8.11min,在所用剂量范围内(0.5-2mg/kg)其动力学特性符合线性动力学过程,肾脏是RGD-SAK的主要体内排泄途径。 进一步对RGD-SAK进行了较为系统的安全性评价。急性毒性最大耐受量试验结果表明,单次皮下注射给予250mg/kg体重最大耐受剂量后14天未见小鼠死亡,体重增长正常,证实本品急性毒性低;恒河猴长期毒性试验证实RGD-SAK低(1.5mg/kg)、中剂量(7.5 mg/kg)对恒河猴无明显毒性作用,高剂量(15mg/kg)RGD-SAK主要毒性反应靶器官为凝血系统和肾脏,本试验表明RGD-SAK对猴静脉和皮下注射长期毒性剂量为15mg/kg (临床用量50倍),安全剂量为7.5 mg/kg (临床用量25倍),无毒性作用剂量为1.5 mg/kg (临床用量5倍);溶血试验结果表明,RGD-SAK对红细胞无溶血或粘集反应;鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验和哺乳动物体外细胞染色体畸变试验结果表明RGD-SAK无致突变和致畸作用。上述结果说明,RGD-SAK符合进一步深入开展临床试验的安全毒理学要求。 通过该课题研究,建立了较为成熟的中试生产工艺,为进一步深入研究和大规模生产奠定了基础。体内外研究发现,RGD-SAK具有高效溶栓和防栓的作用,同时具有预防血管再狭窄的形成。RGD-SAK临床前药效学、药代动力学和安全性评价的完成为进一步开展RGD-SAK临床研究打下了基础。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R341

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