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《复旦大学》 2007年
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环孢素A促进人早孕期母—胎界面交叉对话的分子机制

周雯慧  
【摘要】: 从免疫学角度,自然妊娠是一种特殊类型的半同种异体移植。母体对胚胎这种“天然移植物”的免疫耐受是妊娠得以建立和维持的内在本质。妊娠失败多与母体免疫调节功能异常对胚胎产生免疫排斥有关。因此阐明母-胎免疫调节机制及如何改善妊娠结局一直是生殖免疫学的研究热点。 环孢素A(CsA)自20世纪70年代应用于临床以来,作为免疫抑制剂发挥了重要的作用;是目前公认的抑制移植排斥反应最为有效的药物。我们课题组前期体外研究发现,低浓度CsA(10~(-4)~1.0μmol/L)可以明显抑制滋养细胞凋亡,并促进其增殖、迁移与侵袭;体内实验发现,妊娠失败模型孕鼠经CsA治疗后,母-胎界面IFN-γ分泌降低,IL-10分泌增加,CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞扩增。胚胎吸收率下降。这些结果提示CsA对母-胎界面具有良好调节作用,可改善滋养细胞生物学功能,并有利于母-胎界面Th2型免疫偏移和免疫耐受产生,可望成为一种新型保胎制剂。 本研究在前期工作基础上,进一步解析CsA作用于人早孕期滋养细胞的可能分子机制,同时分析CsA对母-胎界面另两群重要细胞,蜕膜基质细胞(DSC)与蜕膜免疫细胞(DIC)生物学功能的调节作用,为CsA的临床应用提供科学依据。 1、CsA通过SDF-1/CXCR4自分泌作用促进人早孕期滋养细胞增殖与侵袭 应用本实验室建立的胰酶消化、密度梯度离心法成功分离、培养人早孕期滋养细胞,采用RT-PCR、In-cell Western和ELISA法从基因和蛋白水平分析CsA对滋养细胞SDF-1、CXCR4表达的调节作用。结果显示,CsA通过MAPK/ERK1/2信号途径明显促进人早孕期滋养细胞SDF-1与CXCR4的转录和翻译。用MTT法和侵袭试验评价CsA对滋养细胞增殖与侵袭能力的调节作用是否涉及SDF-1/CXCR4信号通路。结果发现,SDF-1/CXCR4中和抗体能有效消除CsA对人早孕期滋养细胞增殖与侵袭的促进作用。为探讨SDF-1/CXCR4信号通路介导CsA促进人早孕期滋养细胞侵袭的可能机制,我们对侵袭试验中上清液进行了明胶酶谱试验,发现SDF-1/CXCR4中和抗体也能有效消除CsA对人早孕期滋养细胞MMP9/MMP2分泌的上调作用。本部分研究证实,CsA通过MAKP/RK1/2信号通路促进人早孕期滋养细胞表达SDF-1/CXCR4,上调的SDF-1/CXCR4反应轴增强滋养细胞增殖与侵袭功能。 2、DSC加强CsA对人早孕期滋养细胞的促侵袭作用 成功分离、培养人早孕期DSC,以人早孕期滋养细胞为对照,采用RT-PCR、免疫化学和ELISA的方法分析DSC SDF-1/CXCR4的表达。结果显示,与滋养细胞共表达SDF-1/CXCR4不同,DSC转录和翻译CXCR4,而不表达SDF-1。MTT试验发现,外源性SDF-1不影响DSC的体外增殖能力;滋养细胞条件培养液(TCM)虽可促进DSC增殖,但SDF-1或CXCR4中和抗体不能消除TCM对DSC的促增殖作用。明胶酶谱分析发现,外源性SDF-1处理DSC可明显促进其MMP9/MMP2分泌,相应抗体可有效阻断SDF-1对DSC MMP9/MMP2分泌的促进作用。据此推测,SDF-1/CXCR4相互作用可能通过加强滋养细胞与DSC共同分泌MMP9/2促进两者对话与交流。 在解析了SDF-1/CXCR4信号通路对DSC生物学功能的可能调节作用后,采用MTT试验、In-cell Western、ELISA法和明胶酶谱分析进一步研究CsA对DSC增殖、SDF-1/CXCR4表达及MMP9/MMP2活性的影响。发现与CsA明显上调滋养细胞SDF-1/CXCR4的表达不用,各种浓度(10~(-4)~1.0μmol/L)CsA对体外培养的DSC增殖及SDF-1/CXCR4的表达模式无明显影响;CsA主要促进DSC分泌MMP9/MMP2。 建立DSC与滋养细胞共培养系统(VCT/DSC),发现经1.0μmol/L CsA处理后,各试验组滋养细胞侵袭能力均明显高于相应未处理组;而CsA处理的VCT/DSC直接或间接共培养系统中滋养细胞侵袭力明显高于单独滋养细胞CsA处理组。明胶酶谱分析结果与侵袭试验十分相似,1.0μmol/L CsA处理48h后,各种不同培养系统中滋养细胞侵袭能力明显增高的同时,其MMP9与MMP2的分泌也相应增加(P<0.01);VCT/DSC直接或间接共培养系统经CsA处理后,MMP9与MMP2水平也明显高于单独滋养细胞CsA处理组(P<0.01)。 本部分研究提示,CsA可同时促进人早孕期DSC与滋养细胞共同分泌MMP9与MMP2,这有助于共培养系统中滋养细胞与DSC的协作与交流,进一步增强滋养细胞侵袭能力。 3、CsA对人早孕期母-胎界面IL-10/IFN-γ平衡的调节作用 应用ELISA法分析人早孕期滋养细胞、DSC及DIC IL-10与IFN-γ的分泌情况,进而探讨CsA对这三种细胞及其共培养系统IL-10/IFN-γ表达的调节作用。结果发现,人早孕期滋养细胞、DSC和DIC均可自发分泌IL-10。CsA对单独培养的滋养细胞、DSC和DIC IL-10的分泌虽没有明显影响,但是当它们两两或三者共培养时,经CsA处理后IL-10分泌水平均明显高于相应未处理组。尤其对三者共培养系统,CsA可明显促进IL-10的分泌。体外培养的人早孕期滋养细胞和DSC未检测到明显IFN-γ的分泌,IFN-γ主要由DIC产生。CsA对单独培养的DIC IFN-γ的分泌没有明显影响,但是当DIC与DSC和滋养细胞共同培养时,CsA可明显下调共培养系统IFN-γ分泌。 本部分研究结果证实,CsA可促进人早孕期滋养细胞、DSC和DIC共培养系统IL-10的分泌,同时抑制IFN-γ产生。母-胎界面整体水平IL-10上调,IFN-γ下调,将有助于产生Th2型免疫偏移。 综上所述,本研究发现低浓度CsA对人早孕期母-胎界面具有多重调节作用:(1)通过促进滋养细胞自分泌SDF-1升调节其增殖与侵袭能力;(2)促进DSC与滋养细胞的对话与交流,增强滋养细胞的侵袭功能;(3)促进利于妊娠维持的Th2型免疫偏移。提示CsA的药理作用机制远远超过人们迄今为止的认识,它可能成为一种新型保胎制剂,为临床治疗反复自然流产等免疫相关妊娠疾病提供了一种新的策略。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R714

【参考文献】
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