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《复旦大学》 2007年
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COPD伴AHR大鼠神经内分泌免疫网络若干指标变化及补肾益气药对其调节作用的研究

崔焱  
【摘要】: 目的: 通过观察慢性阻塞性肺疾病伴气道高反应性(COPD伴AHR)大鼠模型相关的激素和若干炎性因子的变化,来研究慢性阻塞性肺疾病伴气道高反应性大鼠模型下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis,HPA轴)和若干细胞因子的变化规律;并与COPD大鼠模型进行对比研究。同时从大鼠模型的症状、病理学改变、肺功能改变、HPA轴的变化、炎性细胞因子的变化等,观察补肾益气中药对它们的调节作用。 方法: 实验分为两部分: 第一部分:模型组的制作 1.1造模与分组: 健康清洁级雄性挪威大鼠(Brown Norway,BN)120只,体重180~220g。分为四组,每组12只。 A组:COPD伴AHR模型组:以卵蛋白致敏、激发、气管内滴注内毒素(LPS)及熏烟BN大鼠制作COPD伴AHR模型。 B组:哮喘反复发作模型组:第一天用100mg卵蛋白加氢氧化铝凝胶1ml的混悬液进行致敏,第14天用浓度为5%的卵蛋白生理盐水溶液进行雾化激发,每天1次,连续7天,停止激发7天之后,再激发7天。 C组:正常对照组:不做任何处理。 D组:COPD模型组用气管内滴注内毒素(LPS)及熏烟BN大鼠制作COPD模型。 1.2标本采集与检测: 所有大鼠均在上午8∶30~10∶30麻醉,其中,A组与B组在最后一次用卵蛋白激发后半小时内麻醉,先测所有大鼠肺功能(FEV_1、FVC)、气道阻力等,并取下丘脑、心脏血、肺泡灌洗液、肺组织等标本。用Realtime-PCR方法检测下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)mRNA的表达;放射免疫法检测血浆中促肾上腺皮质激素(ACTH)的浓度;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清和灌洗液中的IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α和血清皮质酮(CORT)。 第二部分:用药组模型制作 2.1造模与分组:造模方法同第一部分的A组与D组。按照复方不同剂量分为六组,每组12只。 E组:COPD低剂量用药组 F组:COPD中剂量用药组 G组:COPD高剂量用药组 H组:COPD伴AHR低剂量用药组 L组:COPD伴AHR中剂量用药组 M组:COPD伴AHR高剂量用药组 E、F、G用药组在造模第8天开始灌胃,每只2ml,用不同剂量补肾益气中药连续灌胃21天,第29天先测大鼠肺功能(FEV_1、FVC)、气道阻力等,然后取各组大鼠的肺组织、心脏血、肺泡灌洗液、下丘脑组织,检测方法同前。 H、L、M用药组在开始熏烟后第八天开始灌胃,每只2ml,用不同剂量补肾益气中药连续灌胃21天,最后一天先用卵蛋白激发,再测(FEV_1、FVC)、气道阻力,检测方法与第一部分相同。 结果: 第一部分:模型组与正常对照组的变化规律 1.HPA轴变化: 1.1下丘脑CRHmRNA: 经对数转换,4组下丘脑CRHmRNA比较,差别无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,哮喘反复发作组与COPD组比较有统计学意义(P<0.05),COPD组与正常组比较有显著性差异(P<0.01)。COPD模型组与COPD伴AHR模型组中,CRHmRNA值均有下降,其中COPD伴AHR模型组中,下降得最明显。 1.2血浆ACTH: 经对数转换,4组血浆ACTH比较,无统计学意义(P>0.05)。 1.3血清CORT值:4组血清CORT值比较,有统计学意义(P<0.05)。其中COPD伴AHR模型组与COPD模型组的血清CORT值均降低。 2.细胞因子的变化: 2.1血清IL-4:4组血清IL-4比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,COPD伴AHR组与COPD组比较,有统计学意义(P<0.05)。血清IL-4在哮喘反复发作组中升高明显。 灌洗液IL-4:4组灌洗液IL-4比较,无统计学意义(P>0.05)。在COPD模型组中,IL-4有升高。 2.2血清IL-5:4组血清IL-5比较,有显著性差异(P<0.01),呈上升趋势。其中两两比较,哮喘组与COPD组比较有显著性差异(P<0.01)亦即在COPD组中所测的血清IL-5明显高于哮喘组;COPD组与正常组比较有统计学意义(P<0.05)。 灌洗液IL-5:4组灌洗液IL-5比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,COPD伴AHR组与哮喘组比较,高于哮喘组,有显著性差异(P<0.01)。 2.3血清IL-6:4组血清IL-6比较,有统计学意义(P<0.01)。血清IL-6值在哮喘反复发作组中最高。 灌洗液IL-6:4组灌洗液IL-6比较,IL-6值呈上升趋势,有显著性差异(P<0.01)。其中两两比较,COPD伴AHR组与COPD组比较有显著性差异(P<0.01);哮喘组与COPD组比较,有统计学意义(P<0.05)。灌洗液IL-6值在COPD模型组中升高。 2.4血清IL-8:4组血清IL-8比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,哮喘组与正常组比较有统计学差异(P<0.05);哮喘组与COPD组比较有统计学意义(P<0.05);哮喘组的血清IL—8值高于正常组和COPD组。 灌洗液IL-8:4组灌洗液IL-8比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,COPD伴AHR组与哮喘组比较有显著性差异(P<0.01);哮喘组与COPD组比较有显著性差异(P<0.01)。 2.5血清TNF-α:4组血清TNF-α比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,COPD伴AHR组与哮喘组比较有显著性差异(P<0.01);哮喘组中的值高于COPD伴AHR组中的值。 灌洗液TNF-α:4组灌洗液TNF-α比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,COPD组与正常对照组比较差别有显著性(P<0.01)。 2.6血清IFN-γ:4组血清IFN-γ比较,无统计学意义(P>0.05)。 灌洗液IFN-γ:4组灌洗液IFN-γ比较,无统计学意义(P>0.05)。其中两两比较,哮喘组与正常对照组比较有显著性差别(P<0.01);COPD组与正常对照组比较有统计学差异(P<0.05)。 3.肺功能的变化 正常组的肺功能最佳,哮喘反复发作组、COPD模型组、COPD伴AHR模型组的大鼠肺功能减弱,4组组间比较,FEV_1有统计学意义P<0.05。FVC没有统计学意义,P>0.05。其中哮喘反复发作组与正常组比较,P<0.05 第二部分 1.用药组HPA轴变化规律: 1.1下丘脑CRHmRNA: COPD低、中、高剂量用药组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01);且COPD低、中、高剂量用药组之间比较,有统计学意义(P<0.05);低剂量组时上升明显,高剂量时反而呈下降的趋势。COPD低、中、高剂量用药组与COPD模型组比较,有统计学意义(P<0.05)。COPD伴AHR低、中、高剂量用药组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01)随着用药剂量的增加,CRHmRNA先呈下降的趋势,然后再呈上升的趋势。但较正常组均有上升的趋势。其中两两比较,COPD低剂量组与COPD模型组比较有统计学意义(P<0.05);COPD低剂量组与COPD高剂量组比较有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR模型组与COPD伴AHR低剂量组比较有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR模型组与中剂量和高剂量组比较均有显著性差异(P<0.01)。 1.2血浆ACTH:经对数转换,COPD低、中、高剂量组与正常对照组、COPD模型组比较,没有统计学意义(P>0.05);COPD伴AHR低、中、高剂量组与正常对照组、COPD伴AHR模型组比较,有统计学意义(P<0.05),随着剂量的增加,呈下降的趋势。 1.3血清CORT:COPD低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD中、高剂量组比较,有显著性差异(P<0.01),中剂量组时血清CORT含量较高;COPD伴AHR低、中、高剂量组比较有显著性差异(P<0.01)随着剂量增加,CORT值呈升高的趋势;COPD伴AHR低剂量组与中剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低剂量组与高剂量组比较,差别有显著性(P<0.01);COPD伴AHR中剂量组与高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR模型组与中剂量组比较,差别有显著性(P<0.01); 2.用药组细胞因子的变化: 2.1血清IL-4:COPD低、中、高剂量组与正常组、COPD模型组比较,有统计学意义(P<0.05)。随着剂量的增加,血清IL-4值略呈下降的趋势。COPD伴AHR低、中、高剂量组与正常组、COPD伴AHR模型组比较,有显著性差异(P<0.01)。用药组中的血清IL-4值比正常值和模型组中的IL-4值低。 灌洗液IL-4:COPD低、中剂量组比较,有显著性差别(P<0.01);COPD低、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05)。 2.2血清IL-5:COPD伴AHR高剂量组与正常对照组比较,有显著性差别(P<0.01)。 灌洗液IL-5:COPD低、中剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD低、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD高剂量组与正常对照组比较,有统计学意义(P<0.05)。 2.3血清IL-6:COPD低、中、高剂量组比较,有显著性差别(P<0.01),随着剂量的增加,IL-6呈下降的趋势;COPD低、中、高剂量组与COPD模型组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD低、中剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD低、高剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD中、高剂量组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD伴AHR高剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01)。 灌洗液IL-6:COPD伴AHR低、中、高剂量组比较,有统计学差异(P<0.05);中剂量组时,IL-6值降到最低点。COPD伴AHR低、中剂量组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD伴AHR低、高剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR中剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR高剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01); 2.4血清IL-8:COPD低剂量组与COPD模型组比较有显著性差异(P<0.05);COPD高剂量组与COPD模型组比较有显著性差异(P<0.05)。 灌洗液IL-8:COPD低、中、高剂量组与COPD模型组比较,有统计学差异(P<0.05);高剂量组时IL-8下降得最多。COPD低剂量组与COPD高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低、中、高剂量组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD伴AHR低剂量组与中剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR中剂量组与高剂量组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD低、中、高剂量组分别与正常对照组比较,差别均有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01)。 2.5血清TNF-α:正常对照组、COPD模型组、COPD低、中、高剂量用药组比较,差别有统计学意义(P<0.05);高剂量组时,血清TNF-α值最低。COPD低、中、高剂量用药组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD低剂量组与高剂量用药组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD模型组与COPD高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05)。 灌洗液TNF-α:COPD低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);中剂量组时,TNF-α值降得最低。COPD伴AHR低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05),随着剂量的增加,TNF-α值呈下降的趋势。 2.6血清IFN-γ:COPD低、中、高剂量组、正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01);随着剂量的增加,血清IFN-γ值呈下降的趋势。COPD低、中、高剂量组三组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD低剂量组与高剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR模型组、COPD伴AHR低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低、中、高剂量组分别与COPD伴AHR模型组两两比较,有统计学意义(P<0.05)。 灌洗液IFN-γ:COPD低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD低、中、高剂量组、COPD模型组比较,有统计学差异(P<0.05);COPD低、中剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR低、中、高剂量组比较,有统计学意义(P<0.05);COPD伴AHR低剂量组与高剂量组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR中剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01):COPD伴AHR高剂量组与正常对照组比较,有显著性差异(P<0.01);COPD伴AHR低剂量组与COPD伴AHR模型组比较,差别有显著性(P<0.01):COPD伴AHR中剂量组与COPD伴AHR模型组比较,有显著性意义(P<0.01); 3.用药组肺功能的变化 COPD低、中、高剂量组随着补肾益气中药剂量的增加,各组的FEV_1与FVC变化不明显,说明补肾益气中药对COPD模型的肺功能改善作用不大。,COPD伴AHR低、中、高剂量组随着用药剂量的增加,肺功能的指标FEV_1与FVC相应的增大,且高剂量组中最为明显,与低剂量组比较,有统计学意义。说明了COPD伴AHR模型组是存在气道阻塞部分可逆的情况,通过用药改善了它的肺功能。 结论: 1、COPD伴AHR大鼠模型HPA轴功能低下与紊乱; 2、IL-8、TNF-α是参与COPD气道炎症过程的重要的细胞因子。IL-6可能参与了COPD的气道炎症过程。在本实验中,在COPD伴AHR模型中,IL-8和TNF-α升高明显,推测它们参与了COPD伴AHR的气道炎症过程。其中,IL-8在哮喘反复发作中也起了一定的作用。 3、在COPD伴AHR模型组中,血清和灌洗液的IL-4值均有升高,而IFN-γ下降明显,推测IL-4/IFN-γ平衡可能在COPD伴AHR发病中起到一定的作用。 4、由仙灵脾与黄芪组成的补肾益气方可以改善HPA轴功能,调节机体免疫。同时能够改善COPD伴AHR大鼠模型的肺功能。 5、可能参与COPD、COPD伴AHR、哮喘的相关细胞因子,见表1 6、COPD和COPD伴AHR的HPA轴相关指标的变化及补肾益气药的调节作用,见表2。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R285.5

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【引证文献】
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