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《复旦大学》 2007年
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早孕期人蜕膜基质细胞趋化因子CCL2表达调控及其在母—胎界面Th2型偏移中的调节作用

贺银燕  
【摘要】: 趋化因子是一类小分子的肝素结合蛋白,分子量通常为8-14kDa,趋化因子和其含有七次跨膜结构的G蛋白偶联受体结合,在病理生理反应中发挥重要的作用。四年前我们率先开展了母胎界面趋化因子调控机制的研究,发现趋化因子和趋化因子受体在母胎免疫调节中发挥重要的作用。我们发现,早孕滋养细胞能分泌CXCR4的配体SDF-1和CXCR6配体的CXCL16。CXCR4/SDF-1相互作用,能募集CD56~(bright)CD16~-NK到达蜕膜局部。CXCR6/CXCL16结合,能够趋化外周血T细胞、γδT和单核细胞到达母胎界面,并且促进这些蜕膜局部免疫活性细胞的黏附。因此,在母—胎界面,趋化因子是蜕膜免疫活性细胞和滋养细胞相互作用和对话的媒介,而且不同的趋化因子受体/配体对作用于不同的免疫活性细胞,各自发挥着不同的作用,共同参与母胎免疫调节。CCL2是CC类趋化因子中最早被鉴定的趋化因子之一,CCL2和受体CCR2结合后,在炎症、动脉粥样硬化、肿瘤等过程中发挥重要的作用。CCL2还能诱导Th2型免疫应答。本研究中筛选了人早孕蜕膜组织和蜕膜基质细胞18种趋化因子受体和相关配体的表达,发现蜕膜组织和蜕膜基质细胞高水平转录CCL2和CCR2。我们以此为切入点,展开了CCR2/CCL2在母—胎界面生物学功能的研究,以阐明母胎界面蜕膜基质细胞和蜕膜免疫活性细胞间相互对话的分子和机制,进而揭示趋化因子在母—胎界面免疫调节网络中的作用。 1.人早孕蜕膜和蜕膜基质细胞趋化因子受体及配体的转录特征 探讨人早孕蜕膜及蜕膜基质细胞趋化因子受体及相应配体的表达,及其在母—胎界面的调节作用。采用半定量RT-PCR分析正常早孕人蜕膜组织和原代培养的蜕膜基质细胞18种趋化因子受体及其相应配体mRNA的表达。结果显示,人早孕蜕膜组织高表达CCR2、CCR5、CCR10;中等强度表达CCR3、CCR6、CCR9、CXCR1、CXCR4,CCR1、CCR4、CCR7、CCR9、CXCR3、CXCR5-6仅在部分蜕膜组织中表达;不表达CXCR2、XCR1、CX3CR1。蜕膜基质细胞也高表达CCR2、CCR5、CCR10;中等强度表达CCR7、CCR9;低表达CCR1、CCR3、CCR4、CCR6、CXCR6,XCR1、CX3CR1;不表达CXCR1-CXCR5。同时蜕膜组织和蜕膜基质细胞均高水平转录CCR2配体CCL2(MCP-1),CCL13(MCP-4)和CCL28(CCR10配体),中等强度转录CCL7(MCP-3,CCR2配体),不转录CCL27(CCR10配体)。 2.趋化因子CCL2及其受体CCR2在早—孕期母胎界面的表达 分析人早孕蜕膜及蜕膜基质细胞趋化因子受体CCR2及其配体CCL2在人早孕蜕膜组织及蜕膜基质细胞的表达和分泌,以探讨CCR2/CCL2在母—胎界面的生物学作用。收集早孕期蜕膜组织,分离蜕膜基质细胞,免疫化学方法分析正常人早孕蜕膜组织和培养的人蜕膜基质细胞CCR2/CCL2表达;ELISA检测培养的蜕膜基质细胞上清中CCL2的分泌;用流式细胞术分析蜕膜基质细胞表面CCR2和细胞内CCL2的表达;流式细胞术检测蜕膜免疫活性细胞表面CCR2的表达。结果显示,原代培养DSC的纯度为98.25%±1.74%;人早孕蜕膜组织和蜕膜基质细胞均高水平转录和翻译CCR2和CCL2,10例样本中CCR2的阳性率为84.65%±4.57%,CCL2的表达率为53.11±6.03%;蜕膜基质细胞分泌高水平的CCL2,达21.72±2.34ng/ml,其分泌呈时间依赖性;约34%的蜕膜CD56~+CD16~-CD3~-NK、50%CD4~+T和66%左右的CD14~+单核细胞表达CCR2。 3.CCL2对人早孕蜕膜基质细胞自分泌调控作用 应用MTT法分析外源CCL2对蜕膜基质细胞促增殖效应;给予ERK/MAPK抑制剂U0126和CCR2受体抑制剂RS102895不仅拮抗外源性CCL2的促增殖效应,还能抑制蜕膜基质细胞CCL2的分泌;Th2型细胞因子IL-4和Th1型细胞因子IFN-γ能诱导蜕膜基质细胞分泌CCL2,IL-4和IFN-γ对蜕膜基质细胞分泌没有协同作用,IL-4和TNF-α却显示出很强的协同作用;不同浓度的雌激素、孕激素和人绒毛膜促性腺激素能增加蜕膜基质细胞CCL2的转录,从而诱导CCL2的分泌。本研究表明,人早孕蜕膜基质细胞能通过ERK/MAPK途径自分泌CCL2,Th2和Th1型细胞因子能相互作用促进蜕膜基质细胞分泌CCL2,雌激素、孕激素和人绒毛膜促性腺激素可上调蜕膜基质细胞CCL2的分泌。 4.蜕膜基质细胞通过分泌CCL2参与维持母胎界面Th2型免疫偏移 经不同方法处理DIC后,用FCM法检测DIC的凋亡;FCM分析DIC细胞内Th1型和Th2型细胞因子的表达;CBA法检测DIC Th1型和Th2型细胞因子的分泌;应用Real time PCR分析DIC转录因子GATA-3和T-bet的表达。研究结果表明,rhCCL2和蜕膜基质细胞培养上清能促进DIC细胞Th2型细胞因子-IL-4和IL-10的表达和分泌,降调节Th1型细胞因子-IFN-γ和TNF-α的表达和分泌,从而诱导母胎界面向Th2型偏移。CCL2还能促进DIC细胞内GATA3转录,抑制T-bet的转录,从而介导DIC Th2细胞因子优势表达和分泌。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R714

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