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国产石杉科药用植物的分子生物学研究

姬生国  
【摘要】: 石杉科(Huperziaceae)植物是一类多年生小型草本植物,土生、附生或生于苔藓丛中,直立或下垂生长,喜阴凉潮湿环境。近年来随着对石杉科植物的开发和利用,使得石杉科植物资源逐渐减少。因此,对石杉科植物资源有效的合理保护与科学的开发利用工作已迫在眉睫。本课题针对这一状况,为了解决石杉科药用植物的资源匮乏问题,保证石杉科药用植物资源的可持续开发和利用,进行设计和研究。本论文首先对我国的石杉科植物的生态状况、资源情况、分类情况以及石杉碱甲在石杉科植物中的分布、研究状况、药理作用等作了详细的分析和描述,并着重进行如下研究。 1.对石杉科植物的分子生物学研究 利用基因组学对石杉科药用植物进行研究。通过对不同种石杉科植物的总DNA的提取,选择叶绿体基因rbcL,rpL16,marK及psbA-trnH间区进行PCR扩增并测序,通过序列比对并构建系统进化树进行分析,结果阐明了石杉科植物系统位置和分类关系。系统进化树中石杉科与石葱属Phylloglosum位于系统树的姊妹枝,共同组成的进化枝与石松科Lycopodiaceae植物平行排列,这一结果与形态学上的分类方法是一致的,支持了将石杉科独立于石松科植物的分类观点。对石杉科的属下分类,系统进化拓扑树表明,该科植物中明显的包含了两个进化枝,即石杉属植物进化枝和马尾杉属植物进化枝,这一结果提示了石杉科植物中两个属的划分的正确性,确立了石杉科植物的系统分类关系,即石杉属Huperzia与马尾杉属Phlegmariurus的分类方法。这一方法与形态学的分类方法相辅相成,这一结果是对于捷克植物学家Holub对该属分类的不确定性的有力的答复。并对属下的分类做了进一步的研究,系统树上石杉属中石杉组和小杉兰组的植物明显地被分为两个聚群,这一结果同张丽兵、孔宪需的分类学观点相一致。由于马尾杉属的供试材料不足,其属内系统演化结果尚不明朗,有待于进一步的研究。本研究还确立了长柄石杉应为蛇足石杉的一个变种,这一观点得到了系统树的支持。伏贴石杉虽然与小杉兰在形态学上很难区分,在系统树上该两种植物分别聚于不同的演化枝,并有很高的Bootstrap支持率,这一结果可以明显的把小杉兰和伏贴石杉区分开,伏贴石杉应该为一个独立的种。 通过对不同基因序列比对并通过遗传距离及碱基差异的分析,表明了石杉科植物之间存在一定的差别,特别是属间有较大的差别,为属间鉴定提供了重要的鉴定依据。一些形态上相似难以鉴定的种,如蛇足石杉与长柄石杉;东北石杉、伏贴石杉和小杉兰之间可以通过碱基差异及遗传距离的不同进行准确的鉴定,为石杉科植物在分子鉴定提供了简便、可靠的鉴定方法。 2.进行了两种石杉科植物蛋白质表达谱的研究 利用蛋白质组学技术对石杉科药用植物进行了研究。为探讨石杉科植物中主要有效活性成分石杉碱甲生物合成的途径奠定了基础。分析比较了石杉碱甲含量差别较大的东北石杉和伏贴石杉中的蛋白质的2-DE表达谱,优化了从石杉科植物中提取纯化蛋白质的方法。从东北石杉的蛋白质表达谱中分离出蛋白质斑点1338个,从伏贴石杉中分出蛋白质斑点1269个。273个差异蛋白质斑点多集中在分子量在15-75KDa和pH4-7之间。通过对137个成功获取的蛋白质斑点的鉴定,有60个蛋白质斑点鉴定成功。其中在有贡献的16个蛋白质斑点中,斑点Ha22号蛋白质存在于石杉碱甲含量高的伏贴石杉中,而不含石杉碱甲的东北石杉中无此斑点,该蛋白质在动物体内为一种丝裂原调节蛋白Mrp3,而在植物体内该蛋白质的作用机理尚不清楚,由于该蛋白质是存在于两种石杉碱甲含量明显不同,但生长环境和形态相似的两个种中的明显差别蛋白质,它的存在有可能与石杉碱甲的生源途径有一定的相关性,因而改变了不同的石杉科植物中的石杉碱甲的含量的高低。另外的15个蛋白质在两个种都存在着差异,表明,这些有差异的蛋白质都有可能参与了石杉碱甲的生物合成途径。以上结果还需要进一步的试验验证。本实验为寻找参与石杉碱甲合成的功能基因或蛋白质提供了重要的参考资料。该研究将为对石杉科药用植物次生代谢产物的生物合成途径以及与基因和蛋白质的关系的研究奠定了坚实的基础。 本实验研究在国内外尚未见文献报道,属国际首创。该研究为中药植物资源的合理开发和保护提供了一个全新的研究思路。


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