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腺病毒介导的HCCS1基因抗肿瘤作用及其机制的研究Prohibitin(PHB)作为肿瘤血清标志物的初步研究

甘愉  
【摘要】: HCCS1是通过对肝细胞癌病人染色体17p13.3区域的杂合性缺失进行分析发现的新抑癌基因。研究显示,在肝细胞癌组织中HCCS1的表达水平明显低于癌旁正常组织。将HCCS1基因克隆后转染人肝癌细胞株发现,其在体外和体内均可以明显抑制肝癌细胞的生长。上述结果显示了HCCS1基因在肝癌的发生、发展过程中起着重要的作用,同时提示了其作为抗肿瘤治疗基因的应用价值。本实验以腺病毒为载体探讨HCCS1作为治疗基因在肿瘤生物治疗中的运用前景,并对其抑癌作用的分子机制做了初步的探索。 我们利用AdEasy系统构建并包装携带有HCCS1基因的复制缺陷型腺病毒Ad-HCCS1,并通过半定量RT-PCR和Western blot确定证实Ad-HCCS1感染能介导细胞HCCS1的高表达。将重组病毒感染293细胞进行大量扩增,通过CsCl梯度离心纯化病毒,并运用293细胞空斑形成实验对纯化的Ad-HCCS1和对照腺病毒Ad的滴度进行测定,其滴度分别为4.5×10~(10)和3×10~(10)。细胞存活试验结果显示Ad-HCCS1对人肝癌细胞BEL7404和人结肠癌细胞SW620的生长具有显著的抑制作用(P<0.01),而对人正常胚肺成纤维细胞NHLF的作用较弱。同时,在荷人结肠癌SW620的裸鼠模型中,瘤内注射Ad-HCCS1能明显抑制移植肿瘤的生长(P<0.01),并发现重组腺病毒介导HCCS1的高表达能诱导细胞出现凋亡特征性的凋亡小体,TUNEL试验和Annexin V结合试验也表明细胞凋亡的发生。对其分子机制的研究发现,在HCCS1诱导的细胞凋亡过程中,Bcl-2家族成员Bax而非Bid被剪切,并插入线粒体膜,引起细胞线粒体膜电位的改变,从而导致细胞色素C(Cyto C)的释放。释放到胞浆的Cyto C进一步通过活化caspase-9和caspase-3促进细胞的凋亡,caspase-9特异性抑制剂或caspase广谱抑制剂都能明显缓解HCCS1诱导的细胞凋亡。而在凋亡过程中则未检测到caspase-8和caspase-12的活化。HCCS1高表达也能导致AIF从线粒体释放到胞浆,但其并不进一步转位入细胞核促进凋亡。此外,还发现HCCS1的高表达能引起溶酶体蛋白酶cathepsin D释放到胞浆,而抑制cathepsin D的活性能明显减弱HCCS1诱导的细胞凋亡。 综上所述,本课题通过所构建的携带有HCCS1基因的重组腺病毒证实了HCCS1的抑癌作用,并对HCCS1作为治疗基因在抗肿瘤基因治疗中的应用前景做了初步的研究。同时,研究结果显示HCCS1可通过诱导细胞凋亡来发挥其抑癌作用。对凋亡机制的研究发现,线粒体/caspase-9/caspase-3途径在HCCS1诱导的细胞凋亡中起着重要的作用。此外,HCCS1高表达还能够触发溶酶体途径的细胞凋亡。 PHB作为一种潜在的抑癌基因,其不仅定位于线粒体发挥分子伴侣的作用,同时也在细胞核内发挥转录调控的作用,在细胞增殖、分化及凋亡等重要过程中起着重要的作用。近来的研究显示发现,PHB不仅在多种肿瘤细胞及肿瘤组织中表达增高,其在肿瘤病人血清中也高表达,提示了PHB作为肿瘤标志物的运用价值。本研究通过考察PHB在本地区胃癌及结肠癌病人组织及血清中的表达情况,对其作为胃癌及结肠癌血清肿瘤标志物的可能进行探讨。 我们构建PHB的原核表达载体pQE30-PHB,并用IPTG诱导蛋白表达,以Ni-NTA树脂亲和层析柱纯化蛋白。用纯化的PHB蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞融合后筛选分泌抗PHB蛋白的杂交瘤细胞,将其接种小鼠制备腹水并用Protein A亲和层析柱纯化抗体。通过筛选及进一步鉴定获得的1株效价较高的抗PHB单克隆抗体。用免疫组化检测肿瘤组织中PHB表达水平的改变。结果显示在胃癌及结肠癌组织中PHB的表达水平明显高于癌旁正常组织(p<0.01),且肿瘤组织中PHB的水平和肿瘤的分化程度也存在相关性,即分化程度较低的肿瘤PHB表达水平较高(p<0.01)。在此基础上,我们建立PHB的时间分辨免疫荧光分析方法(TRIFA),进一步检测肿瘤病人血清中PHB表达水平的改变。结果显示胃癌病人和结肠癌病人血清PHB水平和相应正常血清PHB水平没有明显差别(p>0.05),而本研究中年龄、性别等混杂因素并未对统计结果造成偏移。而对正常人血清PHB的检测分析发现,不同性别间的血清PHB表达水平不一致。 我们的结果提示了PHB作为一种肿瘤标志物和肿瘤发生、发展密切相关,肿瘤组织PHB表达检测结果为其可进一步将其运用于临床肿瘤疾病的辅助诊断、治疗、病程分析及预后判定奠定了基础。而PHB作为一种血清肿瘤标志物有待于进一步的研究。


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