收藏本站
《复旦大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

神经干细胞体内外分化与体内移植延缓失神经肌肉萎缩的实验研究

沈云东  
【摘要】: 第一部分绿色荧光蛋白(GFP)转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞体外培养与诱导分化的实验研究 目的探讨绿色荧光蛋白转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞(GFP-NSC)体外增殖、分化的生物学活性,并探索一种体外诱导神经干细胞向神经元分化的培养方法。 方法1、对GFP转基因大鼠的胚胎脊髓神经干细胞进行体外分离、培养和诱导分化,并应用特异性抗体分别对神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞进行免疫荧染色鉴定。2、神经干细胞体外连续传代3次以上,在原有神经干细胞培养液中加入Laminin和Heparin两种成份,继续体外悬浮培养5天。之后更换为神经干细胞分化液,诱导神经干细胞体外贴壁分化。分化2周后,应用神经元特异性抗体对神经元进行免疫荧光染色,计数神经干细胞分化为神经元的比例。并应用RT-PCR对分化细胞中突触素的表达量进行半定量检测。以神经干细胞经常规体外培养和诱导分化获得的神经终末细胞作为对照组。 结果1.通过体外分离培养的方法获得了稳定传代的GFP-NSC,经体外诱导分化可以形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。2.本实验改进的胚胎脊髓神经干细胞体外诱导培养方法,使神经干细胞体外分化为神经元的比例明显增加,由原来的不足7%增加到20%以上。 结论1.GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞具有正常神经干细胞的特点,具有良好的生物学活性。2.本实验采用的诱导神经干细胞向神经元分化的方法,可以明显提高神经干细胞分化为神经元的比例,为进一步研究神经干细胞体内分化及体内移植防治骨骼肌失神经萎缩奠定了基础。 第二部分移植神经干细胞在周围神经内存活与分化的实验研究 目的应用不同方法处理GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞,对其移植于周围神经内的存活与分化情况进行研究。 方法1.构建携带神经营养因子NT3的慢病毒载体,并转染神经干细胞。2.建立F344大鼠胫神经切断的动物模型,将神经干细胞(实验组1)、经过体外向运动神经元诱导的神经干细胞(实验组2)及同时转染NT3的神经干细胞(实验组3)分别制成单细胞悬液移植于胫神经远侧段。细胞移植后4周、12周取材。分别应用神经元、运动神经元、神经胶质细胞、轴突以及突触素等的特异性抗体对胫神经冰冻切片进行免疫荧光染色,应用乙酰胆碱受体和突触素的特异性抗体对肌肉组织冰冻切片进行免疫荧光染色。对神经干细胞体内是否能够分化为神经元和运动神经元,分化形成的运动神经是否能够发出轴突,以及分化形成的神经元是否能够与失神经肌肉建立突触连接等问题进行研究,并比较各实验组神经干细胞体内分化情况的变化。 结果GFP-NSC移植于周围神经后,可以长期存活,可以分化形成星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、运动神经元,而且分化形成的神经元可以发出轴突向远端生长。细胞移植后12周,实验组失神经肌肉表面突触素大量聚集,突触后膜形态较好,已接近正常肌肉突触后膜的形态。经体外诱导的神经干细胞体内移植后向神经元分化的比例明显提高而且时间提前;经体外诱导并转染NT3的神经干细胞分化为神经元的比例进一步提高。根据各组中神经元分化比例、运动神经元出现时间及突触素表达强度等结果进行比较,实验组3优于实验组2,实验组2优于实验组1。 结论1.GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞体内移植后可以分化为运动神经元,并可以发出轴突到达失神经肌肉;2.神经干细胞经过体外向运动神经元诱导或同时转染NT3以后,其体内分化为神经元的比例明显提高,而且神经元出现的时间也明显提前。该结果为进一步研究神经干细胞体内移植防治骨骼肌失神经萎缩奠定了基础。 第三部分神经干细胞移植延缓失神经肌肉萎缩的实验研究 目的探讨神经干细胞移植于周围神经后,对于延缓失神经肌肉萎缩的效果。 方法建立F344大鼠胫神经切断的动物模型,将神经干细胞(实验组1)、经过体外向运动神经元诱导的神经干细胞(实验组2)以及体外诱导同时转染神经营养因子NT3的神经干细胞(实验组3)分别制成单细胞悬液移植于胫神经远侧段。细胞移植后4周、12周取材。测量小腿三头肌肌湿重,并分别应用HE染色、Mallory三色染色的方法对失神经肌肉组织进行染色,同时应用突触后膜乙酰胆碱受体(AchR)特异性抗体对肌肉冰冻切片进行免疫荧光染色。应用图像分析软件对各组动物腓肠肌纤维截面积和突触后膜面积进行测定,并进行统计学分析。 结果各组动物失神经肌肉之肌湿重、肌纤维截面积和突触后膜面积均出现不同程度的下降,但三个实验组结果均优于对照组,各实验组间比较,实验组3优于实验组2,实验组2优于实验组1,结果经统计学分析,存在显著性差异。 结论1.GFP转基因大鼠胚胎脊髓神经干细胞体内移植后发挥了延缓失神经肌肉萎缩的作用,同时对维持突触后膜的形态发挥了重要的作用。2.神经干细胞经过体外向运动神经元诱导或同时转染神经营养因子NT3后,其延缓肌肉萎缩的效果明显增强。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R651.3

手机知网App
【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 陈立;大鼠肌卫星细胞体外培养及移植延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究[D];复旦大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 顾玉东;提高周围神经损伤的诊治水平[J];中华创伤骨科杂志;2003年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李爱丽;周钢;范恩学;刘娜;;全脑缺血再灌注血管性痴呆大鼠海马和丘脑NT-3及FGF的动态变化[J];吉林大学学报(医学版);2006年01期
2 孙毅;赵冬梅;张烨;刘洪付;黄飞;;胎鼠前角运动神经元的取材与培养研究[J];滨州医学院学报;2009年06期
3 杨建华,马杰,范遗恩;胚胎干细胞在脊髓损伤中的应用[J];创伤外科杂志;2004年03期
4 郑林丰;易西南;;周围神经损伤的再生与修复的哲学启示[J];创伤外科杂志;2006年01期
5 石光清;刘昌雄;张朝跃;邱娟;向谷良;易西南;郑林丰;戴中伟;;坐骨神经逆行示踪放射自显影显像的初步实验研究[J];创伤外科杂志;2008年04期
6 张华;蒋电明;;汶川地震转运部分伤员闭合性周围神经损伤的早期治疗[J];创伤外科杂志;2008年06期
7 曾英玉;李欣;梁瑞桥;杨云;;副神经切断移位修复肩胛上神经的手术配合[J];当代护士(学术版);2008年05期
8 陈文提;;神经干细胞在中枢神经系统疾病治疗的研究进展[J];福建医药杂志;2007年02期
9 陈国智;朱益华;徐国兴;;神经细胞粘附分子在眼科学中的研究进展[J];国际眼科杂志;2007年04期
10 罗云;NT-3在神经系统中的作用及其对脑缺血的影响[J];国外医学(神经病学神经外科学分册);2003年02期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 顾立强;陈国奋;裴国献;相大勇;任高宏;李绍光;凌旭;朱立军;郭刚;胡罢生;;双重股薄肌移植重建全臂丛根性撕脱伤后手握持功能[A];中国康复医学会修复重建外科专业委员会第十四次全国学术交流会论文集[C];2004年
2 张喜林;郭汝宝;谢远军;严隽陶;;推拿手法对骨骼肌不同方式损伤后肌肉萎缩的影响[A];第十三次中医推拿学术年会暨推拿手法治疗脊柱相关疾病高级培训班论文汇编[C];2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 佟雷;神经干细胞诱导分化为施万样细胞及其信号转导机制探讨[D];中国医科大学;2009年
2 申茉函;重组人Aβ_(1-42)的制备及促进细胞凋亡作用的实验研究[D];吉林大学;2011年
3 刘勇;几丁糖/聚乙烯醇神经导管修复周围神经缺损的实验研究[D];第二军医大学;2011年
4 刘靖;神经干细胞的分化状态影响它们对VEGF的趋化性应答[D];苏州大学;2011年
5 顾芸;背根节神经嵴干细胞的分离培养和分化的研究[D];苏州大学;2011年
6 李红运;p75NTR基因修饰O2A祖细胞对成年大鼠损伤脊髓的修复作用[D];第三军医大学;2002年
7 张正丰;腺病毒介导人心肌营养素-1基因转移对大鼠脊髓损伤的修复作用[D];第三军医大学;2002年
8 卓杰;小鼠胚胎干细胞的体外标记、诱导分化及颅内移植研究[D];天津医科大学;2003年
9 朱巍;转基因神经干细胞移植对脑缺血后神经血管保护作用的研究[D];复旦大学;2003年
10 黄小辉;NT-3转染雪旺细胞在外周神经损伤修复中的作用[D];第四军医大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 范亚珍;脐血源性神经干细胞中Foxg1和Nestin的表达及移植对HIBD新生大鼠影响的研究[D];郑州大学;2010年
2 黄建跃;白细胞介素-2对神经干细胞增殖的影响[D];浙江大学;2010年
3 修光辉;三七、天麻对神经干细胞分化的影响及蛋白质组学研究[D];昆明医学院;2011年
4 李晓飞;骨髓基质干细胞移植联合应用G-CSF对大鼠脊髓损伤修复的影响[D];兰州大学;2011年
5 吴元波;CD4~+CD25~+调节性T细胞对成人眼肌型重症肌无力临床转归的影响[D];安徽医科大学;2011年
6 叶维霞;超声微泡造影剂联合脂质体介导pNogo-R shRNA转染神经干细胞的体外实验研究[D];重庆医科大学;2011年
7 张兴海;人胆固醇酯水解酶重组腺病毒载体的构建[D];辽宁医学院;2011年
8 张志荣;丙烯酰胺致周围神经损伤修复中雪旺细胞功能蛋白的作用研究[D];中国疾病预防控制中心;2011年
9 乔晓俊;脂肪间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[D];郑州大学;2011年
10 王春梅;头皮位点药物注射对HIBD新生大鼠内源性神经干细胞增殖分化及Nogo-A mRNA的影响[D];郑州大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李方华;弓慧敏;冯士彬;庞全海;;骨骼肌卫星细胞的研究进展[J];中国畜牧兽医;2010年10期
2 张风河;魏奉才;黄萍;孙树洋;王克涛;;绿色荧光蛋白转基因鼠咀嚼肌肌卫星细胞的分离、体外培养、鉴定及生物学特性的研究[J];华西口腔医学杂志;2007年02期
3 邵素霞,张雷,赵春芳,郑力芬,闫蕴力,马洪骏;新生大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养及标记方法[J];基础医学与临床;2004年01期
4 汪茜;王明新;蒲传强;;小鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定[J];解放军医学杂志;2009年02期
5 张志;谢富康;冯英;;大鼠肌卫星细胞成肌分化的体外实验研究[J];解剖学报;2006年04期
6 于秋华;朱道立;;大鼠快肌卫星细胞移植在肌肉钝挫伤模型中的修复作用[J];江苏农业科学;2010年01期
7 张力;范明;王伟;陈晓萍;刘淑红;孙亮;;改良法体外培养大鼠成肌细胞的实验研究[J];军事医学科学院院刊;2007年01期
8 刘福强;刘畅;杨彪;梅晰凡;;新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定[J];辽宁医学院学报;2008年01期
9 金鹏;金丽娟;李学奇;;成体干细胞移植治疗心肌梗死的研究进展[J];中华老年心脑血管病杂志;2007年10期
10 杨成,周树夏,刘彦普,杨耀武;肌肉组织工程的基础研究——高纯度卫星细胞培养方法[J];中国美容医学;2004年01期
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 林森;胚胎脊髓源性神经干细胞体内外诱导分化及其最佳移植时间和防止骨骼肌失神经萎缩效果的实验研究[D];复旦大学;2008年
2 顾施辉;神经干细胞移植延缓失神经肌萎过程中突触形成及其功能的实验研究[D];复旦大学;2009年
3 蒋军健;大鼠骨髓间充质干细胞体内外表达神经营养因子与体内移植延缓失神经骨骼肌萎缩及其机制的实验研究[D];复旦大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 陈荣生;修复断伤11年腕部尺神经1例[J];中华手外科杂志;1994年01期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 王同光,洪光祥,王拴科,王发斌,熊希凯,张艳;细胞外ATP防治失神经肌肉萎缩的实验研究[J];现代康复;2001年01期
2 廖平川,韩梅,杨淑英,刘桂卿,梁炳生,裴连奎;肌电图机电刺激阻止失神经肌肉萎缩的实验观察与临床应用[J];山西医药杂志;1993年01期
3 赵磊;严志强;吕广明;;失神经支配骨骼肌的萎缩机制[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年06期
4 王爱国,李昶,赵素琴;失神经骨骼肌萎缩的研究现状与展望[J];内蒙古医学杂志;2004年07期
5 董玉珍,王发斌,洪光祥;神经营养因子-3质粒转染失神经肌肉的表达[J];中国误诊学杂志;2004年06期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 陈燕花;三磷酸腺苷对小鼠肌源性干细胞的作用及机理的实验研究[D];华中科技大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 王伟;大鼠周围神经劈裂移植治疗失神经肌肉萎缩的实验研究[D];山西医科大学;2007年
中国知网广告投放
相关机构
>华中科技大学
>山西医科大学
相关作者
>陈燕花 >王伟
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026