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《复旦大学》 2007年
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人永生化肝细胞和高转移肝癌细胞的糖蛋白质组学研究及Prohibitin 1上调与肝癌关系的研究

许志宾  
【摘要】: 第一部分人永生化肝细胞糖蛋白质组学研究 本论文提出一种用于大规模分离和鉴定人永生化肝细胞(Chang liver细胞)的N-糖基化糖蛋白的方法。为了从细胞裂解物中高通量地分离N-糖基化糖蛋白,我们先对Chang liver细胞进行裂解、细胞总蛋白溶解以及凝集素亲和层析(包括Concanavalin A (Con A)和wheat germ agglutinin (WGA)),再利用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)对于被凝集素吸附的糖蛋白进行分离,最后利用质谱技术(mass spectrometry,MS)进行鉴定。图像数据经过ImageMaster~(TM) 2-D Platinum软件分析,Chang liver细胞中的蛋白质经Con A吸附后平均检测到323±5(n=3)个蛋白点;经WGA吸附后平均检测到256±5(n=3)个蛋白点。去除重叠的124±5(n=3)个蛋白点后,共吸附455个不同的蛋白点。对于从Chang liver细胞裂解物中吸附的糖蛋白,我们从考马斯染色的电泳胶上切点后进行质谱鉴定,共鉴定了84个蛋白点,其中47个蛋白点是Con A吸附的糖蛋白,代表40个不同的蛋白质;37个蛋白点是WGA吸附的糖蛋白,代表34个不同的蛋白质。去除Con A和WGA都有吸附的点后,共得到70个不同的蛋白质。结果表明,我们建立了一种高通量的糖蛋白质组学的方法分离人肝细胞的N-糖基化糖蛋白。本文的研究内容是人类肝脏蛋白质组学研究项目(HUMAN LIVER PROTEOME PROJECT(HLPP))的一部分,这种方法的建立将有助于促进人类对肝脏细胞N-糖基化糖蛋白的研究。 第二部分人永生化肝细胞和高转移肝癌细胞的比较糖蛋白质组学研究 应用第一部分的方法,我们对比了Chang liver细胞和人高转移肝癌细胞MHCC97-H的N-糖基化糖蛋白表达差异,分析发现7个在MHCC97-H细胞中上调的糖蛋白(p<0.05),其中2个是Con A吸附的糖蛋白,5个是WGA吸附的糖蛋白,并通过质谱技术结合数据库搜索进行了鉴定。鉴定结果表明,Con A吸附的糖蛋白分别为羧酸酯酶(Carboxylesterase)和热休克蛋白96前体(Heat shock protein gp96 precursor),WGA吸附的糖蛋白分别为抑制素(Prohibitin 1,PHB)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(Glutamate-cysteine ligase,modifier subunit)、假定蛋白(Hypothetical protein)、类似B细胞增强因子的新蛋白(Novel protein similar to Pre-B cell enhancing factor,PBEF)和二氢硫辛酰氨脱氢酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,E3 component of pyruvate dehydrogenase complex,2-oxo-glutarate com)。研究报道表明这些糖蛋白与癌症的发生、发展有一定的联系。 第三部分Prohibitin 1上调与肝癌增殖及迁移关系的研究 在第二部分的研究结果中,我们发现prohibitin 1(PHB)在MHCC97-H细胞中明显上调。尽管PHB早被报道为一种肿瘤抑制蛋白,但尚未发现它与肿瘤的关系及其糖基化的报道,所以我们选择PHB作为对象进一步研究PHB上调与肝癌的关系。首先我们对糖蛋白质组学得到的PHB在肝癌细胞中的上调进行验证。通过Western blot和半定量RT-PCR两种方法证明了PHB表达量在肝癌细胞MHCC97-H细胞中比Chang liver细胞上调约2倍。同时我们还通过Western blot比较了4个肝癌病人的正常、癌旁和肝癌组织(pair test p<0.01)的PHB表达量的差异,结果发现在两例病人的肝癌组织中PHB的表达明显上调(p<0.05)。其次,为了研究PHB与肝癌的关系,我们选择其他肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7404、HUH-7、Lmb、MHCC97-L细胞,对其中PHB的蛋白表达水平进行了检测,发现除MHCC97-H细胞外,其他肝癌细胞中PHB的表达量均没有明显上调,尤其是MHCC97-L细胞中PHB的表达量明显低于MHCC97-H细胞。MItCC97-H和MHCC97-L细胞是具有相同遗传背景但转移潜能不同的细胞,所以我们下一步进行PHB与肝癌细胞迁移的关系的研究。我们通过构建PHB表达质粒,在MHCC97-L细胞中瞬时转染PHB表达质粒而使PHB过表达,然后对过表达PHB的MHCC97-L细胞和转染空质粒的MHCC97-L的增殖、迁移能力进行测定。结果表明,PHB在MHCC97-L细胞中过表达对MHCC97-L细胞的增殖抑制率为35%,而细胞的迁移率增加了2.1±0.1倍(p<0.05)倍。最后,我们利用SWISS-PROT数据库预测、免疫共沉淀和凝集素L-PHA印迹验证PHB是一种糖蛋白。我们的结果第一次报道了PHB蛋白是一种N-糖基化糖蛋白,且参与肝癌细胞的增殖和迁移的调控。 综上所述,本实验通过凝集素亲和层析和蛋白质组学技术建立了一种高通量的糖蛋白质组学的方法分离鉴定人肝细胞N-糖基化糖蛋白,并应用这种方法进行Chang liver和MHCC97-H的差异糖蛋白质组学分析,结果筛选出与肝癌细胞相关的7种上调糖蛋白,并对其中的PHB蛋白与肝癌细胞的关系及PHB糖基化进行了初步的研究。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R735.7

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