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WRKY家族调控植物抗逆信号途径分子机制的初步研究

沈怀舜  
【摘要】: WRKY转录因子家族主要存在于高等植物中,其功能主要与植物的防御反应、逆境应答、衰老信号和生长发育等密切相关。 OsWRKY30是水稻中的一个WRKY转录因子,含有2个WRKY结构域,属于WRKY家族第1组的成员。mGFP-OsWRKY30融合蛋白在水稻细胞中定位于细胞核中;OsWRKY30在体外能与W-box结合,具有WRKY转录因子的普遍特征;在酵母细胞中,OsWRKY30具有转录激活功能,通过不同长度的截短突变体的研究确定OsWRKY30的转录激活结构域在其N端。根据上述几个实验结果,可以确定OsWRKY30是转录因子,具有WRKY家族转录因子的典型特征。 进一步研究了OsWRKY30在ABA和干旱诱导下的表达谱,发现OsWRKY30受ABA和干旱诱导,说明OsWRKY30参与了与ABA相关的干旱信号途径;获得了OsWRKY30的过表达转基因植株,通过对过表达转基因植株在干旱条件下的筛选,发现OsWRKY30过表达株系比野生型有更强的耐旱能力。 OsWRKY30同时还受SA、JA和病原菌等多种信号因子的诱导,从功能上提示了与MAPK可能的联系,植物MAPK与防御反应,逆境应答等密切相关。同时,通过分析OsWRKY30蛋白的结构发现OsWRKY30的N端有1个保守的结构域,该结构域含有多个SP位点(Serine-Proline site),是潜在的MAPK磷酸化位点。通过酵母双杂交实验验证3个MAPK成员与OsWRKY30的相互作用,发现OsMAPK5a和OsWJUMK1与OsWRKY30存在相互作用,而OsBWMK1与OsWRKY30没有相互作用。 通过OsWRKY30不同截短突变体与OsMAPK5a和OsWJUMK1相互作用的研究发现,OsWRKY30是通过SP位点与MAPK发生相互作用的,WRKY结构域在WRKY转录因子与MAPK相互作用过程中起了重要作用,当只含有OsWRKY30的N端SP1-6或SP2-5的区域与OsMAPK5a能发生相互作用,但作用相当弱,而在加上WRKY结构域后,这种相互作用增强了很多。但OsWRKY30与两个MAPK的相互作用过程中对WRKY结构域的要求是不一样的:对OsMAPK5a只需要1个WRKY结构域,而对OsWJUMK1需要2个WRKY结构域都存在。通过荧光互补实验,证明了OsWRKY30与OsMAPK5a在水稻细胞中存在相互作用,这是首次从体内证明了WRKY转录因子与MAPK能相互作用。原核表达了OsMAPK5a和OsWRKY30(1-618aa部分),体外磷酸化实验验证了OsWRKY30能被OsMAPK5a磷酸化。这样从不同方面验证了OsWRKY30是MAPK的底物。 对OsWRKY30的N端富含SP位点的结构域在Gengbank数据库中搜索,发现了28个WRKY转录因子都含有此结构域,根据其中最保守的5个连续的氨基酸残基命名该结构域为SPTTG结构域(SPTTG domain)。从拟南芥和水稻转录因子数据库中补充了4个WRKY转录因子,总共获得32个WRKY转录因子含有SPTTG结构域。这32个WRKY转录因子都属于WRKY家族中最保守的第Ia组。 进一步克隆了其中的7个,分别是拟南芥中5个、水稻中2个,加上OsWRKY30一共是8个。研究了这8个WRKY转录因子与MAPK的相互作用。OsMAPK5a与8个WRKY转录因子在酵母细胞中都能相互作用,通过β-gal活性检测以及观察在SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上生长情况,比较了OsMAPK5a与8个WRKY转录因子在酵母细胞中相互作用的强度,其中OsMAPK5a与AtWRKY2、AtWRKY20、OsWRKY30、OsWRKY53和OsWRKY80相互作用较强,而与AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33作用较弱。OsWJUMK1与AtWRKY2、AtWRKY20、OsWRKY30和OsWRKY80相互作用较强,但与OsWRKY53不作用,与AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33作用较弱。克隆了OsMAPK5a在拟南芥中同源的MAPK:AtMAPK3。研究了AtMAPK3与8个WRKY转录因子在酵母细胞中相互作用,结果与OsWJUMK1相应的结果类似。上述实验结果证明了:含有SPTTG结构域的WRKY转录因子与MAPK存在相互作用。进一步在水稻细胞内证明了OsWRKY80与OsMAPK5a存在相互作用。 最后,讨论了SPTTG结构域在联系WRKY家族与MAPK家族中的重要意义,含有SPTTG结构域的WRKY转录因子在抗逆信号途径上的重要作用。


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