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《复旦大学》 2008年
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肛门直肠畸形肠壁内神经支配的相关研究

黄焱磊  
【摘要】: 肛门直肠畸形(anorectal malformations,ARM)是新生儿期最多见的先天性消化道重大畸形之一,发生率约1:1500~5000。虽然通过外科手术治疗能够纠治形态上的畸形,但仍有部分患儿术后存在不同程度的排便功能障碍如污粪、便秘等。近年来研究发现良好的排便功能与直肠末端肠壁内神经系统(entericnervous system,ENS)的发育程度密切相关。维生素A和叶酸是参与生物体胚胎发育、生殖细胞分化和维持正常生理稳态的重要微量营养素。动物实验证实孕期维生素A和叶酸缺乏或过量均可导致子代鼠出现相关系统的畸形,但是否影响肛门直肠发育还未见相关研究报道。另外,ENS的发育也受到体内神经营养因子的调控。 本课题首先研究临床不同类型ARM直肠末端的ENS发育情况,探讨影响ARM术后排便功能障碍的病理机制;其次观察维生素A对胎鼠ARM的发生和末端直肠ENS发育的影响,了解孕期维生素A对ARM形成的可能作用;另外观察孕期叶酸对胎鼠ARM的发生和末端直肠DNA甲基化水平的变化作用,探索叶酸在ARM形成的可能影响;最后研究外源性GDNF对胎鼠末端直肠ENS发育的影响,探讨外源干预措施是否能够使GDNF基因表达上调,从而有助于促进发育不良的ENS继续发育完善。 第一部分先天性肛门直肠畸形直肠末端PGP 9.5和S-100蛋白表达的临床研究 目的研究临床不同类型ARM直肠末端的ENS发育情况,探讨先天性ARM术后排便功能障碍的可能病理机制。 方法收集复旦大学附属儿科医院2001年1月~2005年12月收治的先天性ARM患儿手术切除的直肠盲端标本76例,高位畸形11例,中位畸形26例,低位畸形39例。记录各组的平均胎龄、出生体重和取得直肠标本时的年龄。用免疫组织化学方法检测PGP9.5和S-100蛋白在上述标本切片中的表达水平。 结果 1.三组不同类型ARM患儿出生时的胎龄和平均体重无明显差异(P>0.05)。 2.免疫组化结果: (1)PGP 9.5和S-100在高位畸形组中的表达明显低于中位畸形组(高位vs中位,PGP 9.5的P值=0.0226、S-100的P值=0.0401)和低位畸形组(高位vs低位,PGP 9.5的P值=0.0331、S-100的P值=0.0436),而中位畸形和低位畸形两组之间表达无显著差异(P>0.05)。 (2)高位畸形组和中位畸形分期手术组(19/26例)获取直肠盲端标本时的年龄无明显差异(P>0.05),但PGP 9.5和S-100在中位分期手术组中的表达显著高于同年龄的高位畸形组(PGP 9.5的P值=0.0070、S-100的P值=0.0041)。 (3)与中位畸形分期手术组(19/26)相比,中位畸形一期手术组(7/26)直肠末端中PGP 9.5和S-100的表达明显减弱(一期手术vs分期手术,PGP 9.5的P值=0.0128、S-100的P值=0.0048)。 (4)低位畸形26例男性患儿取得直肠盲端标本时的平均年龄为79.27±58.78小时,13例女性患儿平均年龄为6.15±0.29月,两者差别明显(P<0.0001),但直肠末端PGP 9.5和S-100的表达差异无统计学意义(P>0.05)。 结论ARM直肠末端ENS的发育程度与ARM位置密切相关,高位畸形术后排便障碍发生率高可能与末端直肠ENS发育差有关,中位畸形直肠盲端ENS的发育可随年龄逐渐趋向于成熟。 第二部分孕期维生素A对肛门直肠畸形的影响 目的与乙烯硫脲(ETU)诱导的ARM胎鼠模型相比较,观察维生素A对胎鼠ARM的发生和末端直肠ENS发育的影响,了解孕期维生素A对ARM形成的可能作用。 方法选用SD雌性大鼠80只,体重200~250g,随机分为四组,每组20只。分别为VAD组(孕前2周开始喂以维生素A缺乏饲料至孕期结束)、高VA组(孕前2周开始喂以维生素A补充饲料至孕期结束)、正常VA组(作为阴性对照组,孕前2周开始喂以普通饲料至孕期结束)、ETU组(作为阳性对照组,孕前2周开始喂以普通饲料至孕期结束)。于妊娠第10天,ETU组经胃管注入1%的ETU(125mg/Kg),VAD组、高VA组和正常VA组灌入等量的生理盐水;于妊娠第20天,所有孕鼠行剖宫术取胎鼠。检测各组孕鼠血清维生素A浓度,观察雌鼠受孕率、孕鼠体重、死亡率、流产率、平均每窝胎数、死胎率、活胎鼠ARM发生率、胎鼠平均体重及鼻-臀长,用免疫组织化学方法检测胎鼠末端直肠PGP9.5和S-100蛋白的表达水平。 结果 1.经维生素A缺乏饲料喂养2周后VAD组的血清维生素A浓度明显低于正常VA组(P=0.0310)和ETU组(P=0.0401);经维生素A补充饲料喂养2周后高VA组的维生素A水平明显高于正常VA组(P=0.0036)和ETU组(P=0.0026)。 2.孕鼠: (1)正常VA组和ETU组孕鼠体重随孕周时间呈增长趋势,在不同阶段两组之间体重均无明显差异(P>0.05)。VAD组和高VA组孕鼠体重在孕10天前也呈增长趋势,孕10天后呈下降趋势,同期的体重均明显低于正常VA组和ETU组(P<0.01)。 (2)各组雌鼠的受孕率和死亡率无明显差别(P>0.05)。 (3)在流产率方面,VAD组(76.9%)和高VA组(100.0%)显著高于正常VA组(P<0.0001)和ETU组(VAD组vs ETU组,P=0.0009;高VA组vs ETU组,P<0.0001)。 3.胎鼠: (1)VAD组平均每窝胎数显著低于正常VA组(P=0.0040)和ETU组(P=0.0053),ETU组和正常VA组之间差异无显著性(P>0.05)。 (2)VAD组、正常VA组和ETU组的死胎率分别为36.4%(8/22)、1.2%(2/169)、5.0%(7/140),各组之间在死胎发生率方面差异呈显著性(P<0.05)。 (3)VAD组胎鼠平均体重和鼻-臀长显著低于ETU组和正常VA组(P<0.0001);ETU组和正常VA组之间差异无显著性(P>0.05)。 4.VAD组和ETU组的胎鼠ARM发生率分别为71.4%(10/14)、45.9%(61/133),两组之间差异无统计学意义(P>0.05),在伴发尾部畸形方面两组之间差异也不明显(P>0.05);正常VA组未发现ARM。 5.免疫组化结果: (1)在有肛门胎鼠末端直肠中,PGP 9.5和S-100在VAD组中的表达明显低于ETU组(PGP 9.5的P值=0.0156、S-100的P值=0.0105)和正常VA组(PGP9.5的P值=0.0091、S-100的P值=0.0024),而ETU组和正常VA组两组之间表达无显著差异(P>0.05)。 (2)在无肛畸形胎鼠末端直肠中,PGP 9.5和S-100在VAD组中的表达明显低于ETU组(P<0.0001);VAD组和ETU组的无肛胎鼠末端直肠中的表达均显著低于各自的有肛门胎鼠组(VAD组:PGP 9.5和S-100的P值均<0.0001;ETU组:PGP 9.5的P值=0.0203、S-100的P值=0.0122)。 结论孕期维生素A缺乏会导致胎鼠ARM的形成,胎鼠末端直肠ENS发育程度与母体维生素A水平有关。 第三部分孕期叶酸对肛门直肠畸形的影响 目的观察孕期叶酸对胎鼠ARM的发生和末端直肠DNA甲基化水平的变化作用,探索叶酸在ARM形成中的可能影响。 方法选用SD雌性大鼠80只,体重200~250g,随机分为四组,每组20只。分别为FD组(孕前2周开始喂以叶酸缺乏饲料至孕期结束)、高FA组(孕前2周开始喂以高剂量叶酸饲料至孕期结束)、正常FA组(孕前2周开始喂以普通饲料至孕期结束)、对照组(孕前2周开始喂以普通饲料至孕期结束)。于妊娠第10天,FD组、高FA组和正常FA组经胃管注入1%的ETU(125mg/Kg),对照组灌入等量的生理盐水;于妊娠第20天,所有孕鼠行剖宫术取胎鼠。检测各组孕鼠血清叶酸浓度,观察雌鼠受孕率、孕鼠体重、死亡率、流产率、平均每窝胎数、死胎率、活胎鼠ARM发生率、胎鼠平均体重及鼻-臀长,用PCR方法检测胎鼠末端直肠组织的GDNF甲基化水平。 结果 1.经叶酸缺乏饲料喂养2周后FD组的血清叶酸浓度明显低于正常FA组(P=0.0204)和对照组(P=0.0080);经高剂量叶酸饲料喂养2周后高FA组的叶酸水平明显高于正常FA组(P=0.0242)和对照组(P=0.0405)。 2.孕鼠: (1)各组孕鼠体重随孕周时间均呈增长趋势,FD组孕10天和孕20天的体重增长明显低于其它三组(P<0.05),而其它三组在不同阶段体重均无明显差异(P>0.05)。 (2)FD组受孕率与高FA组相比无明显差别(P>0.05),但低于正常FA组(P=0.0392)和对照组(P=0.0124);高FA组、正常FA组和对照组之间受孕率差异无统计学意义(P>0.05)。 (3)在孕鼠死亡率和流产率方面,各组差异无显著性(P>0.05)。 3.胎鼠: (1)FD组的平均每窝胎数显著低于高FA组(P=0.0002)、正常FA组(P=0.0043)和对照组(P=0.0032),而高FA组、正常FA组和对照组之间差异无显著性(P>0.05)。 (2)FD组、高FA组、正常FA组和对照组的死胎率分别为7.7%(6/78)、3.8%(6/158)、5.0%(7/140)、1.2%(2/169),其中FD组与对照组(P=0.0071)、正常FA组与对照组(P=0.0472)之间差异呈显著性,其它各组之间差异不明显(P>0.05)。 (3)FD组和高FA组胎鼠的平均体重和鼻-臀长均明显低于正常FA组和对照组(P<0.0001);FD组与高FA组、正常FA组与对照组之间,胎鼠体重和鼻-臀长差异无显著性(P>0.05)。 4.FD组、高FA组和正常FA组的胎鼠ARM发生率分别为51.4%、42.8%、45.9%,三组之间差异无统计学意义(P>0.05),在伴发尾部畸形方面三组之间差异也不明显(P>0.05);对照组未发现ARM。 5.甲基化水平检测结果: (1)在有肛门胎鼠末端直肠中,FD组的GDNF甲基化水平显著低于高FA组(P<0.0001)、正常FA组(P=0.0003)和对照组(P=0.0004);而高FA组、正常FA组和对照组之间无明显差别(P>0.05)。 (2)在无肛畸形胎鼠末端直肠中: ①FD组的GDNF甲基化水平明显低于高FA组和正常FA组(P<0.0001),正常FA组的甲基化水平也显著低于高FA组(P<0.0001)。 ②FD组和正常FA组肛门畸形胎鼠末端直肠中的甲基化水平均明显低于各自的有肛门胎鼠组(FD组:P=0.0335;正常FA组:P=0.0267),而高FA组无肛畸形胎鼠末端直肠中的甲基化水平则显著高于同组的有肛门胎鼠组(P=0.0004)。 ③与对照组相比较,正常FA组的无肛畸形胎鼠末端直肠组织甲基化水平低于对照组(P=0.0190),而高FA组仍显著高于对照组(P<0.0001)。 结论母体叶酸缺乏造成甲基来源不足,从而使胎鼠末端直肠组织处于低甲基化状态;ARM末端直肠ENS发育程度可能与组织甲基化水平有关。 第四部分孕期外源性神经营养因子对肛门直肠畸形末端直肠神经系统发育的影响 目的研究外源性GDNF对胎鼠末端直肠ENS发育的影响,探讨干预措施是否能够使GDNF蛋白水平升高,从而有助于促进发育不良的ENS继续发育完善。 方法选用明确受孕的SD雌性大鼠30只,体重200~250g,随机分成ETU组、ETU+GDNF组和对照组,每组各10只。于妊娠第10天,ETU组和ETU+GDNF组均经胃管注入1%的ETU(125mg/Kg),对照组灌入等量的生理盐水;于妊娠第11天,ETU+GDNF组经尾静脉注入20μg GDNF(溶于0.2ml生理盐水),ETU组和对照组经尾静脉各注入0.2ml生理盐水;于妊娠第20天,所有孕鼠行剖宫术取胎鼠。观察各组孕鼠死亡数、平均每窝胎数、死胎数、活胎鼠ARM发生率以及胎鼠的体重和鼻.臀长,用免疫组织化学和Westem-blotting方法检测胎鼠末端直肠GDNF的表达。 结果 1.三组孕鼠均无死亡和流产,各组在平均每窝胎数、死胎数以及胎鼠的体重和鼻-臀长方面均无明显差别(P>0.05)。 2.ETU组和ETU+GDNF组的ARM发生率分别为51.4%、52.5%,两组之间差异无统计学意义(P>0.05);对照组未发现ARM。 3.免疫组化和Western-blotting结果: (1)在有肛门胎鼠末端直肠中,GDNF在ETU组、ETU+GDNF组和对照组中的表达差异无显著性(P>0.05)。 (2)在无肛畸形胎鼠末端直肠中: ①GDNF在ETU+GDNF组的表达明显高于ETU组(P=0.0366);ETU组和ETU+GDNF组的无肛胎鼠末端直肠中的表达均显著低于各自的有肛门胎鼠组(ETU组:P=0.0012;ETU+GDNF组:P=0.0285),也显著低于正常对照组(ETU组vs对照组,P<0.0001;ETU+GDNF组vs对照组:P=0.0265)。 ②GDNF/actin灰度比值在ETU组和ETU+GDNF组中的表达存在显著差异(P<0.0001),在ETU组中表达量最低,在ETU+GDNF组中表达量显著升高,但仍明显低于对照组(P=0.0076)。 结论外源性GDNF虽不能阻断乙烯硫脲诱导ARM的发生,但可使末端直肠肠壁内GDNF蛋白水平升高,从而促进发育不良的ENS继续发育。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R726.5

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