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重组表达过氧化氢酶及抗氧化损伤生物活性的研究

史训龙  
【摘要】: 过氧化氢酶[Hydrogen-peroxide:hydrogen-peroxide oxidoreductase(EC1.11.1.6)]是机体抗氧化酶体系的一个重要组成部分,被发现与许多人类疾病都密切相关,许多研究表明过氧化氢酶具有减轻和治疗急性氧化损伤的作用。从科研及治疗前景的角度来看,人源过氧化氢酶比其他异源过氧化氢酶具有更高应用价值,目前商品化人源过氧化氢酶主要从人血液中提取,还没有大规模发酵获得人源过氧化氢酶的例子。 本研究从人胚胎肝组织中提取总RNA,通过反转录等基因操作手段获得人源过氧化氢酶基因,在毕氏酵母表达系统中进行胞外表达人源过氧化氢酶。结果表明,本研究建立了人源过氧化氢酶酵母分泌表达系统,进行了10L发酵罐发酵,在胞外的平均活力达到600U/ml,最高可以到1400U/ml,并对发酵产物进行了分离纯化,获得了高纯度的人源过氧化氢酶,酶活回收达到69%,纯化倍数达到21倍,经dot-blot和western-blot确证重组表达产物为人源过氧化氢酶,这为大规模制备人源过氧化氢酶奠定了基础。 针对工业用过氧化氢酶很大程度上依赖进口的问题,本论文利用枯草芽孢杆菌胞外分泌的特性,将同源的枯草芽孢杆菌过氧化氢酶基因katA用质粒的方式转入原宿主菌,从转录水平上提高过氧化氢酶基因的拷贝数,达到增加过氧化氢酶分泌表达的目的。结果表明,本研究成功地建立了过氧化氢酶重组枯草芽孢杆菌胞外表达系统,使胞外酶的活力提高到了3500U/ml的发酵水平。高表达的胞外酶使分离纯化变得更容易,通过三步较为简单的分离方法,获得了电泳纯达90%的纯酶,其收率为70%左右。纯化后的酶比活力为34,600U/mg,这与商品化的过氧化氢酶相近。相对于商品化牛肝过氧化氢酶,重组酶具有更好的pH稳定性,热稳定性。本研究为大规模制备工业用的过氧化氢酶提供了一个有益的参考。 目前过氧化氢酶抗急性氧化损伤的研究报告多集中于细胞、离体器官,而进行整体动物的实验较少,给药方式多以注射给药为主,采用鼻腔吸入方式给药用以抗急性肺损伤的实验未见报道,外源性过氧化氢酶用于抗长期自由基氧化损伤的实验还未见先例。本研究利用流感病毒肺炎模型及D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠模型,进行过氧化氢酶抗急性氧化损伤和抗亚急性氧化损伤作用的探索。结果显示,在肺部病变率,肺指数,肺病变病理切片,生命保护作用等方面,给药组均明显优于病毒组,说明在整体动物实验中,鼻腔吸入过氧化氢酶具有明显的抗急性氧化损伤的作用。在D-半乳糖诱导衰老的模型试验中,小鼠腹腔注射聚乙二醇-过氧化氢酶(PEG-CAT),可减轻脑组织,肝脏,心脏,肾脏组织的总抗氧化能力(TAOC)应激性升高和丙二醛(MDA)含量,有显著性差异,肝脏组织的SOD酶活性降低亦得到改善。上述结果表明过氧化氢酶有可能成为临床抗急性氧化损伤,抗长期自由基损伤引发疾病(如衰老)等方面一个有潜力的参考药物。 由于过氧化氢酶短暂的半衰期限制它的作用及应用,因此对酶的修饰就很必要。目前最常见的是对酶进行PEG交联化,但是PEG-CAT用药多是注射给药进入全身血液循环,是系统性的用药,不能定位,而且半衰期也最多到几十小时。目前国外在微球给药的研究方面十分引人注目,不同直径的微球,可以达到多种效果如注射后定位且长期释放的效果。本研究采用多聚乳酸-聚乙二醇微球对过氧化氢酶进行包埋,来考察过氧化氢酶微球的性质。结果表明,本研究成功制备的过氧化氢酶微球,其包埋成功率为90%以上,经测试微球组成比例、外界pH,温度等因素对酶释放的影响等,过氧化氢酶微球给予了可行性的评价,该研究结果为进一步将过氧化氢酶进行长效释放的研究起到了有益的探索。


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