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《复旦大学》 2008年
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几种中药有效成分对脂肪细胞胰岛素增敏作用的研究

何燕铭  
【摘要】: 1.研究益气散聚方中药有效成分黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮等对胰岛素抵抗的脂肪细胞模型糖脂代谢的影响,以了解这些有效成分有无改善胰岛素抵抗的作用。 2.研究黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮等中药有效成分对前脂肪分化的作用以及对分化过程中的相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PeroxisomeProliferator Activated Receptor,PPARγ)和CAAT/增强子结合蛋白α(CAAT/Enhancer Binding Protein,C/EBPα)mRNA表达的影响。并与TZD药物的作用机制进行比较。 3.在研究中药有效成分对胰岛素增敏作用的基础上,进一步观察其对胰岛素抵抗模型细胞胰岛素信号转导通路的作用及相关细胞因子分泌的影响,探讨它们影响胰岛素敏感性的可能作用机制。 4.以药测证,探讨胰岛素抵抗的中医病机特点及治疗原则。 方法 1.几种中药有效成分对胰岛素抵抗脂肪细胞糖脂代谢的影响 胰岛素抵抗脂肪细胞模型的建立与鉴定:将24孔培养板中分化成熟的脂肪细胞以含1%BSA的低糖DMEM培养基培养12h后分为正常葡萄糖正常胰岛素组及高糖高胰岛素组,每组7个样本。干预培养24 h后,通过~3H-脱氧葡萄糖的摄取试验测定两组脂肪细胞对葡萄糖的摄取情况。 葡萄糖消耗试验检测中药有效成分对正常3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的消耗及细胞活性的影响:实验设对照组、各中药有效成分组(黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮)及罗格列酮组。每种中药有效成分和罗格列酮分别采用五个浓度。干预培养24 h,以葡萄糖氧化酶法检测每孔培养液中葡萄糖的含量,与未接种细胞的空白孔的糖含量均值相减,计算葡萄糖的消耗。葡萄糖消耗实验结束后移出培养液,二甲氧唑黄比色法(XTT)检测细胞活力。并结合葡萄糖消耗及XTT检测结果确定药物的最适浓度。 ~3H-脱氧葡萄糖摄取试验检测中药有效成分对胰岛素抵抗模型脂肪细胞对葡萄糖摄取能力的影响:实验设对照组、模型组、中药有效成分组(黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮)及罗格列酮组,干预培养24 h后,在基础状态及胰岛素刺激状态下通过~3H-脱氧葡萄糖的摄取试验测定各中药有效成分对脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。 比色法检测中药有效成分对胰岛素抵抗模型脂肪细胞游离脂肪酸(FreeFatty Acid,FFA)溢出的影响:实验设对照组、模型组、中药有效成分组(黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮)及罗格列酮组,干预培养24 h后,收集细胞上清液,通过比色法检测各组FFA溢出情况。 2.几种中药有效成分对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响 中药有效成分对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响:实验设对照组、中药有效成分组(黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮)及罗格列酮组,在诱导分化的同时加药,药物与分化液同步更换。分化第8天进行油红O染色,拍摄照片。异丙醇处理染色细胞,570 nm波长检测OD_(570)值。 不同中药有效成分对3T3-L1前脂肪细胞分化相关基因表达的影响:实验设对照组、中药有效成分组(黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮)及罗格列酮组,在诱导分化的同时加药,药物与培养液同步更换。分化第8天抽提细胞总RNA,通过实时定量逆转录多聚酶联反应(Realtime- Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)分析脂肪细胞分化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和CAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的mRNA表达。 3.几种中药有效成分对胰岛素抵抗脂肪细胞胰岛素信号转导通路及脂肪细胞因子溢出的影响 ~3H-脱氧葡萄糖的摄取试验检测PI-3K信号转导通路阻滞剂Wortmannnin干预下中药有效成分对胰岛素抵抗模型脂肪细胞葡萄糖摄取的影响:实验设对照组、模型组、中药有效成分组(黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮)及罗格列酮组,Wortmannin干预30min后,各药物干预培养24 h,通过~3H-脱氧葡萄糖的摄取试验测定各组脂肪细胞对葡萄糖的摄取情况。 Western blot方法检测中药有效成分对胰岛素信号转导通路的关键蛋白磷酸化表达的影响:实验设对照组、模型组、中药有效成分组(黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮)及罗格列酮组,干预培养24 h后,收集细胞,提取全细胞蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,通过Western blot方法检测各组酪氨酸磷酸化胰岛素受体β、丝氨酸磷酸化Akt及酪氨酸磷酸化c-Cbl的蛋白表达量。 4.ELISA法检测中药有效成分对Resistin,TNFα等脂肪因子分泌的影响 实验设对照组、模型组、中药有效成分组(黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮)及罗格列酮组,干预培养24 h后,收集细胞上清液。ELISA法测定各组脂肪细胞Resistin及TNFα蛋白分泌的情况。 结果 1.几种中药有效成分对胰岛素抵抗脂肪细胞糖代谢的影响 胰岛素抵抗脂肪细胞模型的建立与鉴定:以正常葡萄糖正常胰岛素组作为葡萄糖摄取的正常基值,高糖高胰岛素组可以使葡萄糖的摄取率下降59.5%。 葡萄糖消耗试验及XTT试验检测中药有效成分对正常3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的消耗及细胞活力的影响:各中药有效成分在适当的浓度均可显著增加正常3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的消耗,黄芪多糖浓度为0.4 g/L时细胞葡萄糖消耗量最大,比对照组增加11%(P<0.01);小檗碱浓度为40μmol/L时细胞葡萄糖消耗量达到最大,比对照组增加20%(P<0.01);蒲黄总黄酮浓度为0.2g/L时葡萄糖消耗量最大,比对照组增加27%(P<0.01)。XTT检测结果显示,黄芪多糖浓度从0.05 g/L到0.4g/L对细胞活力无明显影响:小檗碱浓度超过10μmol/L时,XTT值显著降低,浓度在5μmol/L以下时对细胞活力影响不大。蒲黄总黄酮浓度从0.05g/L到0.4g/L时,对脂肪细胞活力无明显影响。结合葡萄糖消耗实验及XTT检测结果,每种药物选取一种最适浓度,分别为:黄芪多糖0.4 g/L、小檗碱5μmol/L、蒲黄总黄酮0.2g/L、罗格列酮5μmol/L,在最适浓度下各中药有效成分均可促进正常3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗(与对照组比较P<0.01);且对细胞活力无明显影响。 ~3H-脱氧葡萄糖摄取试验检测中药有效成分对基础状态下胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖摄取的影响:3T3-L1脂肪细胞经高糖和高胰岛素联合诱导培养可建立胰岛素抵抗的细胞模型。以模型组(MOD)细胞葡萄糖摄取量作为基值(100%),各组葡萄糖摄取量分别与之相比作为各自葡萄糖摄取率。在基础状态下,MOD组摄取率比对照组(CON)减少了46.8%。不同中药有效成分干预培养24h后,黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮在无胰岛素刺激的基础状态下均可促进模型细胞的葡萄糖摄取。其中,APS组的葡萄糖摄取率最高,为MOD的309.8%(P<0.01),BER组和PTF组分别为MOD组的207.6%(P<0.05)和298.3%(P<0.01)。ROS组为MOD组的385.0%(P<0.01) ~3H-脱氧葡萄糖摄取试验检测几种中药有效成分在胰岛素刺激状态下对胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的摄取影响:以MOD组葡萄糖摄取量作为基值(100%),各组葡萄糖摄取量分别与之相比作为各自葡萄糖摄取率。在胰岛素刺激下,MOD组葡萄糖摄取比CON减少了59.5%。不同中药有效成分干预培养24h后,黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮在胰岛素刺激状态下均可促进模型细胞的葡萄糖摄取。其中,小檗碱组的葡萄糖摄取率最大,为MOD的144.8%(P<0.01),黄芪多糖和蒲黄总黄酮组分别为MOD组的126.8%(P<0.01)和121.7%(P<0.01)。罗格列酮组为MOD的194.9%(P<0.01) 中药有效成分对3T3-L1脂肪细胞FFA溢出的影响 经高糖高胰岛素培养,MOD组FFA溢出与CON组相比有明显上升,增加了17.5%。经不同中药有效成分干预后,细胞上清液的FFA浓度均有不同程度的下降,黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮及罗格列酮组FFA溢出分别比MOD组减少了8.7%、7.1%、16.4%及9.7%(P<0.01或P<0.05)。 2.几种中药有效成分对3T3-L1前脂肪细胞分化及相关基因表达的影响 中药有效成分对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响:黄芪多糖、蒲黄总黄酮及罗格列酮均明显促进细胞的分化(与对照组比较,P<0.01);小檗碱明显抑制脂肪细胞的分化(与对照组比较,P<0.01)。各中药有效成分组分化程度均低于罗格列酮组(与罗格列同组比较,P<0.01)。 中药有效成分对3T3-L1前脂肪细胞分化相关基因表达的影响:黄芪多糖及蒲黄总黄酮明显促进脂肪细胞PPARγmRNA的表达(P<0.01);而小檗碱组PPARγmRNA的表达量显著低于对照组(P<0.01)。黄芪多糖组及蒲黄总黄酮组C/BPαmRNA表达量比对照组明显上调(P<0.01);而小檗碱显著抑制C/EBPαmRNA的表达(与对照组比较,均P<0.01)。各中药有效成分组PPARγ及C/EBPα的mRNA表达量均低于罗格列酮组(P<0.01)。 3.几种中药有效成分对胰岛素抵抗脂肪细胞胰岛素信号转导通路及脂肪细胞因子溢出的影响 ~3H-脱氧葡萄糖的摄取试验检测PI-3K信号转导通路阻滞剂Wortmannnin干预下中药有效成分对胰岛素抵抗模型脂肪细胞葡萄糖摄取的影响: 加入Wortmannin干预后,MOD组葡萄糖摄取率比同样接受Wortmannin作用的CON组下降了47.8%,黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮及罗格列酮干预模型细胞后,葡萄糖摄取比MOD组分别增加了86.8%、190.8%、187.4%和201.1%。在各实验组加与不加Wortmannin的自身比较中,CON、MOD、黄芪多糖和罗格列酮组加Wortmannin后的葡萄糖摄取率比不加Wortmannin时均有降低,分别为不加Wortmannin时的60.3%、45.6%、78.3%和76.9%。而小檗碱及蒲黄总黄酮组Wortmannin干预前后的葡萄糖摄取率并未有统计学差异。 Westernblot方法检测中药有效成分对胰岛素信号转导通路关键蛋白的磷酸化表达的影响:以MOD组InsR B蛋白酪氨酸磷酸化表达量作为基值,各组与之相比计算InsRβ磷酸化表达的相对定量。胰岛素抵抗模型细胞比较与正常细胞相比InsR B磷酸化表达有显著下调(P<0.01);与MOD组比较,各中药有效成分及罗格列酮组均使胰岛素抵抗脂肪细胞模型InsRβ酪氨酸磷酸化表达显著上调(P<0.01)。 以MOD组丝氨酸磷酸化Akt蛋白表达量作为基值,各组与之相比计算磷酸化Akt蛋白表达的相对定量。MOD组丝氨酸磷酸化Akt蛋白表达明显下调(P<0.01);各中药有效成分及ROS组均可不同程度的上调模型细胞Akt蛋白丝氨酸磷酸化水平,各组与MOD组比较均有显著性差异(P<0.01)。 以MOD组酪氨酸磷酸化c-Cbl蛋白表达量作为基值,各组与之相比计算磷酸化c-Cbl蛋白表达的相对定量。MOD组酪氨酸磷酸化c-Cbl蛋白表达显著下调(P<0.01)。各中药有效成分及ROS组均可不同程度的上调模型细胞c-Cbl蛋白酪氨酸磷酸化水平,与MOD组比较均有显著性差异(P<0.01)。 ELISA法检测中药有效成分对TNFα、Resistin等脂肪细胞因子分泌的影响:与CON组相比,MOD组TNFα的分泌有明显上升,增加了57.6%。黄芪多糖及罗格列酮干预后,细胞培养液中的TNFα浓度有不同程度的下降,分别比MOD组减少19.9%(P<0.05)和17.4%(P<0.01)。而小檗碱及蒲黄总黄酮组与MOD组相比TNFα的水平未见统计学差异。 MOD组脂肪细胞分泌Resistin的浓度与CON组相比无统计学差异。黄芪多糖、蒲黄总黄酮及罗格列酮干预后,细胞培养液中的Resistin浓度有不同程度的下降,分别比MOD组减少了27.9%(P<0.01)、13.7%(P<0.05)和30.9(P<0.01)。而小檗碱组与MOD组相比Resistin的水平未见统计学差异。 结论 1、成熟脂肪细胞经高糖高胰岛素培养24h能明显抑制其葡萄糖的摄取,可诱导建立胰岛素抵抗细胞模型。适用于有关药物筛选及机制研究。 2、黄芪多糖、小檗碱、蒲黄总黄酮等中药有效成分可在对培养细胞基本无毒的安全浓度范围内,在基础及胰岛素刺激状态下不同程度增加脂肪细胞对胰岛素的敏感性,改善胰岛素抵抗模型脂肪细胞的糖脂代谢。 3、黄芪多糖及蒲黄总黄酮促进3T3-L1前脂肪细胞的分化,上调分化相关基因PPARγmRNA的表达,表现出类似PPARγ激动剂的效应;小檗碱抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化,减少细胞内脂质的积聚,下调脂肪细胞分化相关基因PPARγmRNA和C/EBPαmRNA的表达,表现出类似PPARγ抑制剂的效应。中药复方中不同成分的作用取向,体现了中药作用的多靶点多途径的特点,为胰岛素抵抗的防治提供新的思路,可以拓宽应用中医药或中西医结合方法防治胰岛素抵抗的途径。 4、APS、BER、PTF可通过对胰岛素信号转导通路的影响而改善胰岛素抵抗。三种有效成分均可促进胰岛素刺激下胰岛素受体B亚基酪氨酸磷酸化水平,从而活化受体后的信号转导通路。APS改善胰岛素抵抗至少有部分是通过PI-3K途径起作用的。而BER和PTF更有可能是通过干预c-Cbl/CAP途径而改善胰岛素抵抗。 5、中药有效成分可以明显降低胰岛素抵抗状态下脂肪细胞TNFα、Resistin等胰岛素抵抗正相关细胞因子的分泌。 6、对益气散聚方中药的主要有效成分的细胞学研究证明这些有效成分有改善胰岛素抵抗的作用,且作用机制并不完全相同。本课题在细胞和分子水平阐明了方药的部分作用机制。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R285.5

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