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《复旦大学》 2008年
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异氟醚预处理对内毒素诱导幼猪急性肺损伤的影响及机制探讨

孙敏莉  
【摘要】: 第一部分吸入不同浓度异氟醚预处理对内毒素诱导幼猪急性肺损伤的影响 目的:1.建立内毒素诱导幼猪急性肺损伤(ALI)模型,为ALI的研究提供动物实验模型。 2.从呼吸力学、气体交换、血流动力学、炎症反应、肺脏病理形态等方面,比较不同浓度异氟醚(0.5MAC、1.0MAC及1.3MAC)预处理对内毒素诱导幼猪急性肺损伤的影响。 方法: 24头5~6周龄、9~14 kg雄性幼猪随机分成4组,每组6头。幼猪麻醉后行气管插管、常规机械通气,分离左颈内动脉及左颈外静脉,分别放置Picco动脉导管和中心静脉导管,用于监测血流动力学及输注液体,每小时测定动脉血气分析,同时监测其生命体征以及相关呼吸参数。实验动物随机分为4组,每组6头。LPS对照组(CON组,n=6),经中心静脉输注脂多糖(LPS)20μg/kg,60min内输注完毕,ALI形成后,行机械通气12h后处死实验动物;0.5MAC、1.0MAC、1.3MAC异氟醚预处理组(分别为0.5MAC组,1.0MAC组,1.3MAC组,每组n=6),分别吸入0.5 MAC、1.0MAC、1.3MAC异氟醚预处理30min,1h后再经静脉输注LPS 20μg/kg,ALI形成后,行机械通气12h后处死实验动物。分别在基础状态(Baseline)、LPS输注后1h(LPS 1h)、LPS输注后2h(LPS 2h)、急性肺损伤形成时(ALI 0h)、急性肺损伤形成4h(ALI 4h)、急性肺损伤形成8h(ALI 8h)、急性肺损伤形成12h(ALI 12h),监测呼吸力学、气体交换、血流动力学、血气分析等各项指标;实验结束后留取肺泡灌洗液(BALF)检测总蛋白(TP)、磷脂含量、肺泡表面张力;检测肺湿干重比(W/D)、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA),及肺组织病理检查;利用放免法测定血浆中TNFα浓度。 结果:1.27头幼猪经静脉输注20μg/kg LPS,实验过程中意外死亡3头。LPS输注3~6 h后可诱导出ALI。ALI判定标准为PaO_2/FiO_2≤300 mmHg,肺动态顺应性(Cdyn)与基础相比下降30%以上。 2.血流动力学:LPS静脉注射后,实验初始阶段0.5MAC组与1.3MAC组相比,0.5MAC组实验动物HR、MABP、CO、SVR及dp/dtmax的较基础值改变大。通过对PVPI的监测发现,1.3MAC组随着实验时间延长,其PVPI较CON组显著增加(P<0.05)。 3.呼吸力学和气体交换:LPS静脉注射后,各组观察时点与基础值相比,其中1.0MAC组MAP、Vd/Vt、pH及PaO_2/FiO_2变化幅度小。 4.肺部炎症反应:各组间比较未见统计学差异。 5.血常规及肝功能:各组间比较未见统计学差异。 6.血浆TNFα动态改变:LPS静脉注射后,各组TNFα均增高,其中1.3MAC组血浆TNFα在ALI形成后与其他3组相比增高幅度降低。 7.磷脂、TP含量、肺泡表面张力及肺W/D:1.0MAC组BALF中TP及肺W/D与CON组相比降低(P<0.05);磷脂及肺泡表面张力各组间比较未见统计学差异。 8.肺组织病理学检查:各组间比较未见统计学差异。 结论:1.成功建立了静脉注射20μg/kg LPS(E.coli 0111:B4)诱导的幼猪急性肺损伤动物模型。 2.和其他两个浓度异氟醚预处理相比较,1.3MAC异氟醚预处理对脓毒症时循环功能有一定稳定和保护作用。此外,该浓度异氟醚预处理后对血浆TNFα上升有轻微地抑制作用。 3.1.0MAC异氟醚预处理可以改善LPS诱导ALI时呼吸力学、气体交换及氧合的改变,降低LPS诱导ALI时肺泡毛细血管通透性。 第二部分线粒体ATP敏感性钾通道在异氟醚预处理内毒素诱导幼猪急性肺损伤中的作用 目的:观察阻断线粒体ATP敏感性钾通道(MitoK_(ATP) channel)对1.0MAC异氟醚预处理后内毒素诱导幼猪急性肺损伤的影响。 方法: 实验动物及试验准备同第一部分。实验用猪6头,经静脉输注MitoK_(ATP)通道特异性阻断剂5-羟基葵酸盐(5-HD)5 mg/kg,30 min后,1.0MAC异氟醚预处理30 min,1h后静脉输注LPS,ALI形成后,行机械通气12 h后处死实验动物,该组为5-HD组(n=6),对照组为第一部分实验中CON组及不同浓度异氟醚预处理组。实验过程中各项观察指标及动物处死后留取标本方法、检测项目均同第一部分。 结果: 5-HD组各项血流动力学指标与1.0MAC组进行比较,两组测得的各项血流动力学指标与基础值相比变化幅度相似,组间比较未见统计学差异。血气分析pH在LPS 1h点,与基础值相比,5-HD组pH值显著下降(P<0.01),而1.0MAC组与基础值相比未见统计学差异。PaO_2/FiO_2在LPS 1h,与基础值相比,5-HD组显著下降(P<0.01),而1.0MAC组则未见统计学差异。 监测外周血白细胞(WBC)计数,发现5-HD组在ALI 4h与ALI 8h点的外周血WBC技术,与CON组和1.0MAC组相比显著减少(P<0.01)。肝功能检测发现随着实验时间延长,5-HD组总胆红素(TBIL)和结合胆红素(CBIL)增高显著,5-HD组TBIL在ALI 8h点较CON组增高且有统计学意义(P<0.05);5-HD组CBIL在ALI 0h、ALI 8h点较CON组增高(P<0.05)。谷草转氨酶(AST)随实验时间延长逐渐增高。谷丙转氨酶(ALT)、AST各组间相同时点比较未见显著性差异。放免法检测血浆TNFα动态变化,在ALI 4h点,5-HD组TNFα较1.3MAC组增高(P<0.05)。 5-HD组与CON组及1.0MAC组相比MPO含量增高(P<0.05),BALF中TP及TPL与CON组相比减少(P<0.05),而肺W/D、MDA,5-HD组与CON组、1.0MAC组相比未见显著差异。 结论:1.使用MitoK_(ATP)通道阻断剂5-HD后,与1.0MAC组相比,对肺损伤时肺毛细血管通透性影响无统计学差异,提示MitoK_(ATP)通道开放与否对肺损伤时肺泡毛细血管通透性无影响。 2.使用MitoK_(ATP)通道阻断剂5-HD后,1.0 MAC异氟醚预处理加重内毒素诱导ALI时肺部炎症。5-HD组BALF中TPL减少,提示MitoK_(ATP)通道关闭后,在炎症时肺泡上皮Ⅱ型细胞(AECⅡ)受损和凋亡增多,致使TPL合成减少,炎性反应加重。 第三部分异氟醚预处理对内毒素诱导急性肺损伤肺组织粘附分子及炎性细胞因子mRNA表达的影响 目的: 研究不同浓度异氟醚预处理及使用MitoK_(ATP)通道阻断剂后对内毒素诱导幼猪ALI肺组织粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、炎性细胞因子(TNFα,IL-6,IL-8)mRNA表达以及肺组织ICAM-1蛋白表达的影响,探讨可能存在的分子机制。 方法: 动物模型和实验分组设计同第一、二部分。动物处死后,取部分右肺中叶于液氮保存。动物实验全部结束后,进行肺组织RNA提取,逆转录后采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)测定肺组织ICAM-1、VCAM-1mRNA及TNFα、IL-6、IL-8 mRNA表达量的相对定量,免疫组化方法检测肺组织ICAM-1蛋白表达。 结果: 5-HD组ICAM-1mRNA表达较1.0MAC组增高(P<0.05),与其他组相比未见统计学差异。VCAM-1mRNA表达各组之间变化幅度不大,未见统计学差异,其中1.0MAC组和5-HD组拷贝数最低。炎性因子TNFαmRNA各组之间比较未见统计学意义。IL-6 mRNA各组拷贝数,CON组最高,但组间比较未见统计学意义。IL-8mRNA各组间比较,5-HD组表达最高,与CON组、0.5MAC组、1.0MAC组以及1.3MAC组相比有显著差异(P<0.05)。使用免疫组化技术,可见各组肺组织ICMA-1表达于肺血管内皮、肺泡上皮及支气管上皮。 结论: 1.5-HD组肺组织ICAM-1mRNA表达增高,结合第二部分实验肺组织MPO增高结果,说明使用MitoK_(ATP)通道特异性阻断剂后,可加重1.0MAC异氟醚预处理后LPS诱导肺损伤时的炎性反应。 2.5-HD组肺组织IL-8 mRNA高表达,在分子水平进一步提示MitoK_(ATP)通道关闭加重炎症反应。MitoK_(ATP)通道关闭,对ALI时炎性反应及促炎因子表达有协同作用。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R614

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