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《复旦大学》 2008年
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硫胺素缺乏对β-淀粉样多肽前体蛋白加工和Aβ生成的作用及机制研究

张骑鹏  
【摘要】: 阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是老年痴呆的最常见类型,其神经病理学特征主要表现为沉积在细胞外的老年斑(Senile plaques,SPs)和细胞内聚集的神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)以及区域性的神经元丧失。目前,对于AD的发病原因及其病理机制了解甚少,尚没有有效的治疗方法。β-淀粉样多肽(β-Amyloid peptide,Aβ)是SPs的主要成分,来源于β-淀粉样多肽前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)的蛋白剪切。大量研究表明Aβ的代谢异常可能是AD起始性的病理环节。研究Aβ的代谢对于探讨AD的发病机理较为重要。 硫胺素(Thiamine)即维生素B_1,是人体必需的营养成分。硫胺素在体内主要以焦磷酸硫胺素(Thiamine pyrophosphate,TPP)的形式存在,TPP是糖代谢途径中的丙酮酸脱氢酶复合体,α-酮戊二酸脱氢酶复合体以及磷酸戊糖途径中的转酮醇的辅酶因子。硫胺素在维持脑内氧化代谢平衡方面也发挥了重要作用。硫胺素缺乏(Thiamine deficiency,TD)会导致以上三种酶类的活性下降、三羧酸循环发生障碍、三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)产生受阻。此外,硫胺素缺乏过程中产生了大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),导致了氧化应激的发生。主要依靠糖代谢提供能量的神经组织对硫胺素缺乏高度敏感,硫胺素缺乏的中枢神经表现称为脑型维生素B_1缺乏症,也称韦尼克—科尔萨科夫综合症(Wernicke-Korsakoff's syndrome,WKS),病人除了有明显的认知丧失、记忆力减退外,晚期WKS病人出现脑室扩大,神经元死亡。其脑内的KGDHC活性也明显降低。在硫胺素缺乏动物模型上,硫胺素缺乏处理的小鼠脑内出现了神经元死亡,小胶质细胞、星型胶质细胞肥大、增生等神经退行性疾病的共同病理表现。此外,研究显示,在AD病人中,TPP含量和TPP依赖型的酶类的活性都有明显的下降,表明硫胺素缺乏可能在AD病理中起了一定的作用。但硫胺素缺乏在AD中的具体作用尚未得到系统的研究。 我们在体外培养的稳定转染了瑞典型突变APP基因(APPsw)的人源神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)上和C57BL/6J小鼠上成功诱导了TD模型,并通过酶连免疫吸附实验、免疫印迹实验、免疫组织化学等技术手段系统地研究了TD对APP加工(APP processing)的影响以及其可能的机制。 首先,在APPsw SH-SY5Y细胞上,TD处理5天导致了大约13.5%的细胞死亡,发生凋亡的细胞增加了2倍。MTT法检测表明TD处理5天导致细胞活力下降了大约50%。第二,酶连免疫吸附实验测定Aβ的结果显示:TD处理显著增加细胞外和细胞内的Aβ的含量。与对照组(胞外的Aβ_(40)和Aβ_(42)分别是5.52±0.12和0.66±0.23 pg/ml·mg)相比,TD5天组胞外的Aβ_(40)和Aβ_(42)分别上升到18.57±2.31和3.85±0.52pg/ml·mg;细胞内的Aβ_(40)和Aβ_(42)分别从对照组的23.4±5.1 7和7.06±1.03 pg/mg分别上升到86.03±8.19和23.52±1.02 pg/mg。第三,免疫印迹实验显示在TD过程中,细胞中成熟形式的APP蛋白水平降低,不成熟形式的APP蛋白水平没有明显变化。说明在TD过程中APP的表达水平没有增加,应该不是导致Aβ积累的原因。第四,酶活力测定的结果表明负责APP加工的β-分泌酶的活性在TD过程中明显增高,而γ-分泌酶的活性在这一过程中没有显著性变化。前人研究结果证实β-site APP cleaving enzyme 1(BACEl)具有β-分泌酶的活性,我们分别从转录以及翻译水平研究了BACE1基因的表达情况,发现在TD处理过程中,BACE1基因的mRNA水平没有明显变化,BACE1的蛋白总量也没有明显改变。然而,与对照组相比,BACE1蛋白的成熟形式增加了大约2倍,而不成熟形式的BACE1降低了大约50%。表明β-分泌酶的活性调节不是通过增加BACE1基因的转录水平或翻译水平,而是通过促进BACE1蛋白的翻译后修饰(BACE1蛋白的成熟过程)来实现的。为了进一步确定β-分泌酶的活性在TD过程中明显增高,我们检测了TD过程中β-分泌酶产物:β-C terminalfragment(β-CTF)的变化,免疫印迹结果显示β-CTF含量在TD过程中明显增高。第五,TD处理5天后,补充硫胺素24小时明显地减弱了BACE1蛋白的成熟过程,下调β-分泌酶的活性,降低了Aβ的积累。表明补充硫胺素对TD引起的Aβ的积累具有一定的补救作用。第六,在TD处理5天时,向培养液中添加β-分泌酶抑制剂24小时可以抑制Aβ和β-CTF的积累。第七,TD增加了细胞内活性氧的积累,抗氧化剂Trolox不仅可以降低TD导致的细胞内活性氧的积累,也抑制了BACE1蛋白的成熟过程和Aβ的积累。表明氧化应激可能是TD引起Aβ积累的内在机制。最后,在TD处理过程中,添加低浓度(250pmol/L)的化学合成的Aβ到培养液里明显加剧了TD导致的氧化应激。表明Aβ的积累增强了TD引发的氧化应激。 以上的离体实验结果在TD小鼠模型上得到了验证:(1)TD处理9天或更长时间会导致丘脑区域的丘脑中线旁丘脑核(Submedial thalamic nucleus,SmTN)出现明显的神经元死亡;(2)在TD小鼠丘脑区域,Aβ_(40)和Aβ_(42)含量显著增加:对照组和TD10天组的Aβ_(40)分别是0.97±0.15和3.34±0.33 pmol/g;Aβ_(42)分别是0.16±0.01和0.49±0.02 pmol/g;(3)TD处理8天后补充硫胺素可以减少丘脑区域Aβ_(42)的积累。 综上,我们的实验结果表明:(1)由TD引起的氧化应激导致了APP蛋白加工过程中产生了更多的Aβ;(2)氧化应激的作用靶点是BACE1蛋白。进一步,TD对β-分泌酶的活性调节是通过促进BACE1蛋白的翻译后修饰(BACE1蛋白的成熟过程)来实现的;(3)Aβ的积累也加剧了TD导致的氧化应激。提示氧化应激和Aβ的积累之间存在着正反馈的效应。 本工作发现硫胺素缺乏引起的氧化应激促进了APP加工中产生更多的Aβ,Aβ的积累反过来加剧了硫胺素缺乏导致的氧化应激。氧化应激和Aβ的积累之间存在着正反馈的效应。这一效应很可能参与了AD的发生、发展。最后,体外、体内补充硫胺素实验都表明及时补充硫胺素可以缓解硫胺素缺乏对APP加工的影响,表明对于出现硫胺素缺乏相关症状的AD病人,考虑及时补充硫胺素是有益的。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R749.16

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