收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

中药复方更年春对β-淀粉样蛋白致PC12细胞损伤的保护作用

王文君  
【摘要】:妇女进入围绝经期以后,卵巢功能减退,出现了血管舒缩症状、神经精神症状,以及骨质疏松、学习记忆力减退,甚至发生阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)。对于AD的治疗尚处于对症阶段,雌激素和中医药在AD防治中的作用正在引起重视。雌激素替代治疗同时增加了子宫内膜癌、乳腺癌、心脏疾患和中风等的发病风险,故受到限制。中医中药对由雌激素下降引起的围绝经期综合征有较好的疗效,因此中医中药对于雌激素下降有关的学习记忆能力减退甚至AD可能有良性调节作用。 我院根据中医理论及多年临床实践,以滋肾柔肝清心泻火为治则制成以补肾为主更年春方(GNC),对更年期综合征疗效良好,尤其可以改善大脑功能、增强记忆能力。既往研究发现,GNC可通过提高雌激素受体(ER)含量对神经内分泌免疫网络起良性调节作用;GNC可以提高大鼠切除卵巢后Morris水迷宫成绩;GNC可提高海马中ERβmRNA和蛋白的表达、调节海马胆碱能指标并可能由此改善学习和记忆能力;而且GNC不导致子宫内膜增生,提示中药GNC对改善学习和记忆能力有潜在的应用前景。 本研究拟通过体外实验研究,解析GNC复方及主要单体成分对神经细胞损伤的保护作用及其分子机制。 第一部分中药GNC对PC12细胞的保护作用 目的探讨、分析中药GNC含药血清和主要单体及其复合物对PC12细胞作用的有效浓度及时间。 方法3月龄SD雌性大鼠去势后随机分组,分别以中药复方GNC颗粒制剂或生理盐水灌服,制备GNC含药血清及正常大鼠血清。以GNC含药血清、正常大鼠血清、F-12培养基(含5%FBS+15%HS,作为空白对照)、GNC复方中主要单体成分芍药苷(Pae)、黄连素(Ber)、知母皂苷A-Ⅲ(Tim)、淫羊霍苷(Ica)及其复合物处理PC12细胞。MTT法检测细胞增殖活力。摸索中药含药血清作用的有效浓度及时间;摸索四种中药单体及复合物(Ica+Tim+Pae+Ber)作用的有效浓度及时间。 结果MTT法显示:不同浓度GNC含药血清培养PC12细胞24h、48h、72h后,均表现在20%浓度对PC12细胞活力的促进作用最强,随着培养PC12细胞的GNC含药血清浓度下降,细胞活力呈逐渐减弱趋势;与正常大鼠血清、空白对照比较,20%GNC含药血清培养PC12细胞24、48、72小时后细胞活力均明显增强。与空白对照比较,各中药单体及单体复合液培养PC12细胞24小时后,细胞活力无明显差异,但Ber在浓度为1umol/L和中药单体复合物在浓度梯度3(含Ber 1umol/L、Tim 1umol/L、Pae 1g/L、Ica 1ng/ml)培养细胞时活力似有升高趋势。 结论在本研究比较的各不同浓度GNC血清中,20%GNC血清为GNC作用PC12细胞最适有效剂量;处理24小时可作为GNC含药血清作用PC12细胞有效时间。 第二部分Aβ25-35导致PC12细胞损伤 目的探讨并分析Aβ25-35导致PC12细胞损伤的有效时间和剂量,以建立阿尔茨海默病体外细胞模型,为后续解析GNC复方及主要单体成分保护神经细胞免受损伤的作用及其分子机制奠定基础。 方法应用不同浓度Aβ25-35处理PC12细胞24h、48h,MTT法测定细胞活力,倒置显微镜观察细胞形态。 结果终浓度分别为5、10、20、及40μmol/L的Aβ25-35培养PC12细胞24h、48h后,MTT法显示的细胞活力均有明显下降(P<0.01);且随着Aβ25-35浓度增加或培养时间延长,细胞活力有明显减弱趋势。倒置相差显微镜观察:对照组细胞密集,细胞间连接紧密,细胞有立体感;在Aβ25-35作用下,有活力细胞数目减少,细胞间连接较松,胞浆较暗淡,细胞碎片较多,贴壁细胞欠透明,部分发生皱缩,胞浆中有较多颗粒。 结论Aβ25-35有明显剂量、时间依赖性地抑制PC12细胞活力作用;采用20umol/1的Aβ处理PC12细胞24小时可制备AD体外模型。 第三部分中药GNC方对Aβ诱导PC12细胞损伤的保护作用及其细胞内信号通路 目的探讨GNC方是否能明确改善神经细胞凋亡?GNC复方哪些成分是保护神经细胞免受损伤的主要成分?GNC方有无提高ER亚型、起到类似SERM的作用?GNC方是否能激活MAPK信号转导途径? 方法设置7个实验组:(1)对照组;(2)Aβ(模型)组;(3)正常大鼠血清组;(4)GNC含药血清组;(5)Ber组;(6)中药单体复合物组;(7)NGF(阳性对照)组。其中(1)组细胞以常规培养基(F-12培养基:含5%FBS+15%HS)与其它各组同步培养;(2)组与(3)-(7)组同步加入Aβ25-35(20umol/L),不加其它药;(3)-(7)组在细胞传代进人对数生长期后(24h左右)分别加药,其中(3)-(6)组加药的浓度根据第一部分摸索的最适浓度加上,(7)组加入终浓度为10 mg/L的NGF。(3)-(7)组分别于加药2小时后加Aβ25-35(20umol/L),继续分别培养24小时,MTT检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western-blotting检测PC12细胞caspase-3、bax和bcl-2、p-ERK1/2、ER亚型蛋白表达。 结果MTT法检测细胞活力显示:与Aβ处理的模型组比较,GNC含药血清组、Ber组、中药单体复合物组、NGF组的细胞活力均明显增强(P<0.01);中药单体复合物组及Ber组细胞活力均明显低于GNC含药血清组(P<0.05和P<0.01);中药单体复合物组细胞活力明显高于Ber组比较,(P<0.05)。 Annexin V-FITC/PI双标记FCM分析PC12细胞早期凋亡显示:与Aβ模型组比较,GNC含药血清组、Ber组、中药单体复合物组、NGF组的PC12细胞早期凋亡率均明显下降(P<0.01);中药单体复合物组及Ber组的PC12细胞早期凋亡率均明显高于GNC含药血清组(P<0.01);中药单体复合物组FCM测得PC12细胞早期凋亡率明显低于Ber组(P<0.01)。Western-blotting结果显示,GNC含药血清、NGF处理的PC12细胞凋亡抑制基因bcl-2表达水平明显高于促凋亡基因bax;中药单体复合物对PC12细胞抑凋亡基因bcl-2表达略高于促凋亡基因bax。各组caspase-3的表达量在Aβ组最高,正常大鼠血清组较Aβ组稍低,Ber组、中药单体复合物组其次,NGF组、GNC含药血清组明显减低,NGF组最低。 Western-blotting检测结果还显示:各组均未能测出ERα蛋白条带,提示ERα不参与对PC12细胞的保护作用。ERβ表达水平高低依次为:GNC含药血清组、中药单体复合物组、NGF组、Ber组、正常大鼠血清组、Aβ组。Western-blotting检测结果还发现:各组中p-ERK1/2含量高低依次为:GNC含药血清组、NGF组、中药单体复合物组、Ber组、正常大鼠血清组、Aβ组。 结论1.GNC含药血清、Ber、中药单体复合物均能抑制Aβ致PC12细胞凋亡,对Aβ致PC12细胞的损伤有保护作用,其中GNC含药血清作用最强,与NGF作用相仿。2.PC12细胞表达ERβ蛋白,但不表达ERα蛋白。GNC复方能明显提高PC12细胞中ERp表达。3.GNC复方能激活神经细胞MAPK信号通路,提高PC12细胞p-ERK1/2的表达。 第四部分GNC方通过ERβ保护PC12细胞免于损伤及其信号转导机制 目的探讨GNC复方是否通过ERK途径介导抗凋亡作用;以及细胞内信号转导途径? 方法实验设置:(1)对照组;(2)Aβ组;(3)MAPK阻断+GNC含药血清组;(4)MAPK阻断+中药单体复合物组;(5)ER拮抗+GNC含药血清组;(6)ER拮抗+中药单体复合物组;(7)GNC含药血清组;(8)中药单体复合物组。分别培养24小时后,AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞仪(FCM)检测PC12细胞早期凋亡;Western-blotting检测各组PC12细胞caspase-3、bax和bcl-2蛋白表达。分别培养10分钟后,Western-blotting检测PC12细胞p-ERK1/2表达水平,分析ER介导的细胞内信号转导途径。 结果与GNC含药血清组比较,MAPK阻断+中药含药血清组、ER拮抗+中药含药血清组的PC12细胞早期凋亡率均明显增加(P<0.01);与中药单体复合物组比较,MAPK阻断+中药单体复合物组、ER拮抗+中药单体复合物组的PC12细胞早期凋亡率均明显增加(P<0.01),提示中药含药血清及中药单体复合物均可通过ER及MAPK途径抑制PC12细胞凋亡。Western-blotting检测结果可以看出:中药含药血清组、中药单体复合物组PC12细胞抑凋亡基因bcl-2含量明显高于促凋亡的bax含量,MAPK阻断+中药含药血清组、ER拮抗+中药含药血清组、MAPK阻断+中药单体复合物组、ER拮抗+中药单体复合物组的PC12细胞中抑凋亡基因bcl-2含量明显低于促凋亡的bax含量;且此4组中caspase-3的表达量也较中药含药血清组、中药单体复合物组明显增加,说明中药含药血清及中药单体抑制Aβ致PC12细胞凋亡的作用至少通过ER和MAPK途径调节bax、bcl-2的表达。 分析中药提高ER含量与信号转导途径间的关系发现:含药血清组及中药单体复合物组PC12细胞有一定量的p-ERK表达,含药血清组p-ERK较中药单体复合物组略多,加入ER拮抗剂后两组PC12细胞均未测出p-ERK表达,提示中药GNC提高p-ERK的表达至少有ER的参与。 结论1.GNC含药血清及中药单体在抑制Aβ致PC12细胞凋亡的作用过程中涉及ER及MAPK信号途径。中药含药血清及中药单体抑制Aβ致PC12细胞凋亡的作用通过ER和MAPK途径调节bax、bcl-2的表达。2.ER介导中药GNC激活MAPK信号通路。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 ;世界新药之窗[J];中国新药杂志;2011年12期
2 ;阿尔茨海默病诊断标准更新[J];浙江中西医结合杂志;2011年07期
3 窦丽波;;阿尔茨海默病的住院护理[J];吉林医学;2011年26期
4 盛树力;;表观遗传学与阿尔茨海默病研究趋势[J];中国神经免疫学和神经病学杂志;2010年06期
5 刘建平;郭蕾;;阿尔茨海默病证候要素研究[J];中西医结合心脑血管病杂志;2011年07期
6 张君嗣;杨卓;;阿尔茨海默病Aβ大鼠模型颈上交感神经节神经传导和突触可塑性的损伤[J];天津医药;2011年07期
7 盖尔;庄稼英;;糖尿病和脑病[J];糖尿病天地(临床);2011年06期
8 董浩然;;降压药有助于避免老年性痴呆症[J];心血管病防治知识;2007年12期
9 黄延红;王俊杰;;阿尔茨海默病的发病机制及治疗[J];济宁医学院学报;2011年03期
10 彭素英;许之驹;李素君;吴燕明;;阿尔茨海默病30例护理效果分析[J];中国民康医学;2011年12期
11 王明宇;杨宇;吴江;;Aβ结合乙醇脱氢酶与阿尔茨海默病[J];中风与神经疾病杂志;2011年07期
12 袁志敏;;生理活动、膳食与阿尔茨海默病风险间关系[J];国际老年医学杂志;2010年02期
13 柳亚锋;李江平;王剑;;脉血康胶囊联合高压氧舱治疗阿尔茨海默病疗效观察[J];黑龙江医学;2011年07期
14 叶忠峰;;阿尔茨海默病患者多项血清因子水平变化规律研究[J];西南军医;2011年04期
15 王蓓;洪震;;聚集素基因和聚集素在阿尔茨海默病研究中的进展[J];中国临床神经科学;2011年04期
16 赵婷;沈甫明;;NALP3炎性复合体在阿尔茨海默病中的作用[J];药学实践杂志;2011年02期
17 李雯雯;孙钢;;结构MRI在诊断Alzheimer’s disease中的作用[J];医学影像学杂志;2011年06期
18 王酉鹤;张玥;;中药对阿尔茨海默病的干预作用[J];辽宁中医药大学学报;2011年09期
19 刘勇;冯秀华;徐茂田;;复方丹参滴丸治疗阿尔茨海默病疗效观察[J];天津中医药;2011年04期
20 刘勇;冯秀华;;天智颗粒治疗轻、中度阿尔茨海默病临床研究[J];中国实用神经疾病杂志;2011年12期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈霞平;涂自良;杜士明;王启斌;张澈;张蓬华;;阿尔茨海默病的药物治疗进展[A];湖北省药学会第十一届会员代表大会暨2007年学术年会论文汇编[C];2007年
2 满永;夏永静;王抒;;载脂蛋白A-Ⅳ基因360位点与阿尔茨海默病和帕金森病的关系[A];中国病理生理学会动脉粥样硬化专业委员会五届一次会议论文集[C];2002年
3 王乃东;赵永波;;阿尔茨海默病的免疫治疗[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年
4 施海姗;侯乐;宁玉萍;郑东;钟笑梅;;不同认知障碍的阿尔茨海默病患者睡眠特点分析[A];中华医学会精神病学分会第九次全国学术会议论文集[C];2011年
5 金元;曹红;葛仁山;;Nestorone和黄体酮对阿尔茨海默病大鼠记忆的影响及机制[A];2009年浙江省麻醉学学术会议论文汇编[C];2009年
6 庞丽;姚建莉;李海红;曹震;徐志峰;尤克增;陈耀文;吴仁华;;9.4T离体型核磁共振频谱对阿尔茨海默病海马谷氨酸变化的研究[A];中华医学会第16次全国放射学学术大会论文汇编[C];2009年
7 潘小玲;王刚;崔佩菁;王瑛;马建芳;任汝静;邓钰蕾;徐玮;汤荟冬;陈生弟;;GAB2基因多态性与阿尔茨海默病的相关性研究[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
8 丛琳;;调控ADAM9基因表达的启动子区多态性对散发性阿尔茨海默病的保护作用[A];2011全国老年痴呆与衰老相关疾病学术会议第三届山东省神经内科医师(学术)论坛论文汇编[C];2011年
9 郭喆;张锦明;姚树林;贾建军;尹大一;田嘉禾;;阿尔茨海默病~(11)C-PIBPET显像临床研究[A];第四届全国中青年核医学学术会议论文汇编[C];2008年
10 吴明德;齐莉容;;102例阿尔茨海默病人的血脂水平分析[A];第四届全国血脂分析与临床学术研讨会暨第九届全国脂蛋白学术会议论文汇编[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵长安;铝致阿尔茨海默病大鼠的效应及补肾填精方的防治机制[D];河北医科大学;2002年
2 黄艳红;植物雌激素对绝经后阿尔茨海默病神经保护机制的研究[D];第四军医大学;2004年
3 顾建钦;老年期痴呆的中西医结合施治及康复研究[D];华中科技大学;2004年
4 宋阳;核磁共振追踪外源性的标记细胞在阿尔茨海默病的细胞治疗中的应用[D];中国医科大学;2006年
5 尹刚;PI3K/AKT信号通路在AD发病中的作用[D];华中科技大学;2011年
6 杜红坚;阿尔茨海默病载脂蛋白E基因多态性及神经电生理研究[D];天津医科大学;2002年
7 佡剑非;Aβ-AD动物模型建立及NGF治疗的实验研究[D];中国医科大学;2005年
8 张葳;雌激素对去卵巢大鼠中枢神经系统保护机制的研究[D];吉林大学;2005年
9 周志昆;中药复方养寿丹对阿尔茨海默病模型海马区神经免疫调节机制研究[D];广州中医药大学;2005年
10 李旻;NGF对表达突变型APP的PC12细胞作用机理的实验研究[D];中南大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈倢;六味地黄丸对快速老化小鼠学习记忆和细胞因子影响的初步研究[D];广州中医药大学;2006年
2 何国军;阿尔茨海默病和血管性痴呆的颅脑核磁共振定量研究[D];第一军医大学;2004年
3 赵琳;维生素E和川芎嗪防治化学药物诱导的阿尔茨海默病的实验研究[D];中国医科大学;2006年
4 庄莹;人参皂苷Rg2对阿尔茨海默病大鼠大脑保护作用的研究[D];吉林大学;2007年
5 肖飞;广东海风藤提取物HS_2对阿尔茨海默病模型的药效学研究[D];暨南大学;2003年
6 李进;功能磁共振成像对阿尔茨海默病相关认知功能障碍及中药防治的研究进展[D];北京中医药大学;2007年
7 唐翠松;轻度认知障碍局部脑代谢的~1H-MRS分析[D];苏州大学;2008年
8 胡薇;小鼠慢性酒精中毒脑神经细胞APP和Aβ蛋白的表达[D];中国医科大学;2009年
9 谭现伟;Aβ_(1-42)寡聚体制备方法的研究[D];北京交通大学;2009年
10 张晓裕;阿尔茨海默病造模条件的优化及去痴灵对该模型的作用[D];暨南大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 李勇;阿尔茨海默病早期警报[N];健康报;2009年
2 赵建中;探寻阿尔茨海默药新贵[N];医药经济报;2009年
3 刘海英;3种与阿尔茨海默病有关激酶亮相[N];科技日报;2010年
4 编译 石头;阿尔茨海默病新药成泡影[N];医药经济报;2010年
5 李勇 译;专家建议补充阿尔茨海默病诊断标准[N];中国医药报;2010年
6 编译 姚立新;阿尔茨海默病防治:缺乏灵丹妙药[N];医药经济报;2010年
7 伊遥;阿尔茨海默病药开发路漫漫[N];医药经济报;2011年
8 华闻;锂盐可防阿尔茨海默病[N];医药经济报;2004年
9 邵建国;靶向阿尔茨海默病[N];医药经济报;2008年
10 心怡;阿尔茨海默病诊断标准[N];医药经济报;2010年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978