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《复旦大学》 2009年
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代谢网络调控提高拟南芥维生素C含量的研究

王子楠  
【摘要】:维生素C,又名抗坏血酸(L-Ascorbate acid,AsA)是植物体内主要的抗氧化物质,存在于大多数植物绿色组织中,在植物的生长和代谢过程中起着重要作用。植物中AsA的重要性不仅在于它为不能正常合成AsA的少数动物(包括人类)提供丰富的维生素C源;而且近年来的研究发现,AsA对于植物自身的抗氧化作用、光合保护以及调节生长发育等都具有非常重要的生理功能。通过基因工程技术提高植物AsA含量,改良植物营养品质和抗性是分子育种新的发展方向之一。AsA的代谢工程研究正在逐渐开展,但是缺乏对代谢途径中基因的系统评价。本研究通过PCR从拟南芥cDNA中获得AsA代谢途径各步骤催化酶的编码基因,在模式植物拟南芥中过量表达AsA合成途径L-半乳糖途径的6个基因和AsA再生途径的一个基因,同时通过RNAi技术抑制AsA降解途径。以评估各基因各途径对植物AsA含量的贡献。 过表达合成途径和再生途径基因的转基因系,经实时定量PCR分析,目的基因表达量多数都有上调。AsA含量的HPLC分析结果显示,合成途径中:各gdpmppase转基因株系中AsA含量最高达到对照的1.32倍;各gdpme转基因株系中AsA含量最高达到对照的1.38倍;各gdpgalppase转基因株系中AsA含量最高达到对照的2.91倍;各galppase转基因株系中AsA含量最高达到对照的1.45倍;各galdh转基因株系中AsA含量最高达到对照的1.21倍;各gldh转基因株系中AsA含量最高达到对照的1.81倍。通过AsA含量的对比和各基因表达量的分析,进一步证实了gdpgalppase在L-半乳糖途径中第一个限速酶基因的地位,显现了它在AsA代谢工程中的重要作用。 抑制降解途径的各RNA干扰株系中,经实时定量PCR分析,目的基因的表达量明显下调,表达量为对照的10%-29%。成功获得了一系列AsA分解代谢途径被抑制的转基因植株。在这些植株中,而AsA含量最高的株系AOi3是对照含量的1.5倍。达到了多数合成途径基因过表达的水准。而增强再生途径的各dhar转基因株系中,目的基因的表达量有一定的上调,AsA含量最高为43.0 mg/100g FW,是对照的1.39倍。 本研究兼顾包括AsA的生物合成,氧化分解和还原再生在内的整个代谢网络,全面系统的评价了代谢网络内各个基因和途径的优劣,深入探讨了AsA的代谢工程,为制定和优化提高植物AsA含量的遗传工程改造策略提供了初步的实验依据。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q946

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