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《复旦大学》 2010年
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肺癌患者组织及血浆miRNA肿瘤标记物的发现及验证

卢韶华  
【摘要】: 肺癌是世界上病死率第一位的恶性肿瘤,虽然目前外科手术及联合治疗有了很大的进展,但欧美国家肺癌的5年生存率仍然约15%。在肺癌患者中,小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)约占15%,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占80%,NSCLC主要包括腺癌(adenocarcinoma lung cancer)及鳞癌(squamous-cell lung cancer)两大类型。 肺癌的治疗方案因不同病理亚型而不同,早期NSCLC手术治疗后的5年生存率为40%,而大部分患者就诊时已处于进展期,已失去了外科手术和多学科根治的最佳时机,导致进展期肺癌的5年生存率仅为8个月。近年来,分子靶向治疗被认为是特异性最高的肺癌个体化治疗方案,但这就要求对肺癌的准确分型。但临床诊断过程中观察者之间的经验差异会导致肺癌的诊断缺乏特异性及准确性。肺癌的个体化治疗应根据肿瘤本身的生物学特性。因此,特异的肺癌分子表型研究有助于更准确地对肺癌进行分子分型、靶向治疗及预后判断。 miRNA (microRNA)是长度在18-25个左右核苷酸的内源性非编码小分子RNA。miRNA在进化上高度保守。miRNA具有多种生物学功能,对生长发育、生理功能尤其在恶性肿瘤的发生发展等过程产生重大影响。与mRNA相比,miRNA在体外更稳定,在体内代谢周期更长,因而更适合作为肿瘤标记物。 目前,绝大多数对miRNA表达进行的研究所用的都是整块的肿瘤组织,其杂交信号可以来自肺癌细胞,也可以来自肺癌组织中的炎症细胞、间质细胞甚至正常肺组织细胞,而这些非目的细胞的比例在不同肺癌组织中可以存在很大的差异,从而造成了结果的不可靠。激光捕获显微切割技术(Laser capture microdissection, LCM)成功地解决了分子生物学研究中组织异质性的问题,即可以迅速、准确地选择并捕获单一种类的靶细胞,甚至于单个细胞。目前而言,该技术已经被运用到了DNA分析和基因表达的研究中。然而该技术尚未在对实体肿瘤的miRNA生物标记物的发现中得以广泛运用。 本课题LCM技术获取纯净肿瘤细胞,与全基因miRNA检测相结合,探寻不同亚型肺癌的miRNA分子标记物。用石蜡标本对上述有表达差异的miRNA进行进一步的验证,旨在明确其在不同亚型肺癌分子诊断中的临床应用。 因为大多数miRNA是组织特异性,在体内长期存在并且在体外能够稳定保存。这就为寻找细胞、组织或循环中肿瘤细胞特异的miRNA标志物,为肿瘤的诊断、预后推测及靶向治疗提供新的理论依据。最新研究发现肿瘤组织来源的循环中的肿瘤细胞miRNA量对肿瘤的诊断是足够的。因此检测循环中的肿瘤细胞来源的miRNA将有可能成为肿瘤早期诊断的重要手段。到目前为止,肿瘤特异性的标志物尚有很大的局限,临床应用中血清中很多肿瘤指标(如CEA、CA199、CA125等)会出现很高的假阳性;同样血清中很多肿瘤指标(如AFP、NSE等)会出现假阴性。因此,较高频率的假阳性或假阴性导致血清中的肿瘤标志物作为临床肿瘤筛选的明显地局限性。因此,有必要寻找一种基于血循环的肿瘤分子标志物,提高它们的敏感性及特异性,以利于肿瘤的早期诊断及早期治疗,以降低肿瘤的死亡率。 近期关于肺癌miRNA的研究已有一些初步进展。并且发现几个miRNA与肺癌的预后密切相关。研究者也试图寻找血细胞或血清中的肺癌特异的miRNA,研究发现非小细胞肺癌患者血清中的miR-25及miR-223明显升高,且很容易用定量RT-PCR方法检测到。但是目前为止尚无其他肺癌血循环中miRNA肿瘤标志物的更深入的研究。 前期研究显示通过检测血浆或血清中的miRNA以诊断疾病是可行的、稳定的及具有可重复性的。因此,有必要也有可能寻找血循环中的特异的肿瘤标志物,以期建立一种无创、快速、稳定且经济的肺癌诊断方法。 本实验对不同亚型肺癌血浆进行全基因组miRNA差异表达分析,发现及初步验证不同亚型肺癌血浆特异性miRNA。将筛选出的特异的miRNAs用做在肺癌高危人群中筛选早期肺癌的分子标记物,具有长远的临床实践意义。 目的:发现不同亚型肺癌组织中的miRNA肿瘤标记物 方法:运用LCM技术从136例正常肺组织、腺癌、鳞癌及小细胞癌中获取纯的上皮细胞。用Agilent最新芯片技术对上述标本进行全基因组miRNA表达分析,并用实时荧光定量RT-PCR (Taqman)加以验证。用GeneSpring GX10软件进行Quantile数据标准化。用未配对t检验(Bonferroni correction)和方差分析(ANOVA)对miRNA芯片数据进行显著性差异性分析。用聚类分析(Hierarchical clustering)进行miRNA基因表达差异的分类。用芯片预测分析方法(prediction analysis of microarrays, PAM predictor and WEAK)对芯片数据进行预测性分析。 结果:在不同亚型肺癌组织中,发现161个miRNA的表达与肺癌显著相关。7个miRNA可以区分正常肺组织及肺癌组织,准确率高达98%;10个miRNA可以区分非小细胞肺癌及小细胞癌,准确率高达99.9%;2个miRNA可以区分例肺腺癌及肺鳞癌,准确率高达93.5%;13个miRNA可以区分肺腺癌、鳞癌及小细胞癌,准确率高达95.5%。定量RT-PCR和miRNA芯片之间相关性(R)平均为0.980。 结论:特异的miRNA表达与肺癌不同亚型有显著的相关性,候选的的特异性miRNA可以区分肺腺癌、鳞癌及小细胞癌,而其中一些miRNA可能预示了肺癌的发病机制。 目的:验证不同亚型肺癌组织中的miRNA肿瘤标记物,明确其在肺癌分子诊断中的临床应用。 方法:运用定量RT-PCR在192例石蜡标本中对7个候选的不同亚型肺癌组织中的miRNA肿瘤标记物(hsa-miR-25, hsa-miR-205, hsa-miR-34a, hsa-miR-375, hsa-miR-29a, hsa-miR-29b, hsa-miR-27a)进行验证。用小RNA U47进行数据标准化。用未配对t检验对miRNA在不同亚型肺癌组织中的表达进行显著差异性分析。用受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve,ROC)及logistic regression分析来评估候选miRNA肿瘤标记物在鉴别不同亚型肺癌的诊断价值。 结果:候选的miRNA肿瘤标记物能鉴别正常肺组织、腺癌、鳞癌及小细胞癌。实验证明:7个miRNA肿瘤标记物能在石蜡组织中鉴别正常肺组织和肺癌及不同亚型肺癌,其中hsa-miR-25及hsa-miR-375组合能鉴别肺腺癌与肺鳞癌准确率达89%(AUC=0.919);hsa-miR-25,hsa-miR-27a, hsa-miR-29a, hsa-miR-29b及hsa-miR-34a组合能鉴别肺腺癌与小细胞肺癌准确率达98%(AUC=0.990),hsa-miR-29b及hsa-miR-375组合能鉴别肺鳞癌与小细胞肺癌准确率达93%(AUC=0.976)。 结论:实验确定7个miRNA肿瘤标记物能准确鉴别正常肺组织和肺癌及不同亚型肺癌,明确其在肺癌分子诊断中的临床应用。 目的:发现不同亚型肺癌患者血浆中的miRNA肿瘤标记物。 方法:运用用mirVana miRNA isolation kit从19例肺腺癌、10例鳞癌、7例小细胞肺癌患者及23例正常对照血浆中抽提总RNA。用Agilent公司的最新miRNA芯片平台进行分析,通过实时荧光定量RT-PCR (Taqman)方法进行初步验证。用未配对t检验对miRNA芯片数据进行显著性差异性分析。用受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve,ROC)来评估候选miRNA肿瘤标记物在不同亚型肺癌的诊断价值。 结果:在不同亚型肺癌患者血浆中,发现64个miRNA的表达与肺癌显著相关。11个miRNA可以区分正常对照及肺腺癌患者,其中hsa-miR-383及hsa-miR-1233组合能鉴别肺腺癌准确率达83%(AUC=0.886);18个miRNA可以区分正常对照及肺鳞癌患者,其中hsa-miR-623及hsa-miR-654-5p组合能鉴别肺鳞癌准确率达82%(AUC=0.843);35个miRNA可以区分正常对照及肺小细胞鳞癌患者,其中hsa-miR-520b及hsa-miR-139-3p组合能鉴别肺小细胞癌准确率达96%(AUC=0.975)。 结论:血浆中的miRNA表达与不同亚型肺癌患有显著的相关性。候选的特异性miRNA可以在血浆中区分肺腺癌、鳞癌及小细胞癌。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R734.2

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【参考文献】
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