收藏本站
《复旦大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

人髓母细胞瘤干细胞样细胞的分离鉴定及放疗对其增殖影响的体外实验研究

汤旭群  
【摘要】: [目的] 体外培养人髓母细胞瘤细胞,并从中分离鉴定人髓母细胞瘤干细胞样细胞;观察干细胞样细胞的生物学特性,包括形态学、CD133阳性比例、单克隆形成率、增殖曲线及细胞周期分布等;分析人髓母细胞瘤复发前后干细胞样细胞的存在、分布特点及细胞增殖状态,比较原发髓母细胞瘤和复发髓母细胞瘤中干细胞样细胞的增殖特性;体外实验观察放疗对人髓母细胞瘤干细胞样细胞和非干细胞样细胞增殖曲线和克隆形成率的影响,并从细胞周期分布变化,周期蛋白表达和DNA损伤修复角度分析髓母干细胞样细胞的放射生物学特性。 [方法] 用无血清培养液(含EGF、bFGF、LIF和B27)培养5例原代髓母细胞瘤和1例髓母细胞瘤细胞株D283,观察其生长特性;流式细胞仪检测髓母细胞系D283和原代髓母细胞无血清培养下不同时间点的CD133阳性细胞比率,以及不同培养条件下(无血清和含血清培养)细胞的形态学特点和CD133阳性比率;单克隆形成实验观察其增殖能力,免疫荧光染色法观察其干细胞样标志物的表达及血清培液诱导其多向分化情况,以初步鉴定髓母干细胞样细胞;用流式细胞仪分选无血清培养的髓母细胞株D283和原代髓母细胞,将其分成CD133阳性细胞群和CD133阴性细胞群,比较两群细胞在无血清培养条件下的生长形态、干细胞标志物表达和增殖情况;免疫缺陷鼠(NOD/SCID)前臂皮下注射观察两群细胞的致瘤性;继发肿瘤再次体外无血清培养,观察其生长特性,检测其CD133阳性细胞比率,用H E和免疫组化染色法观察肿瘤细胞的组织学特点及GFAP,Ki67,及P53等表达情况,并与原代髓母细胞瘤比较,以鉴定髓母干细胞样细胞。 用免疫组化和免疫荧光法观察5例原发髓母细胞瘤及其复发后干细胞样标志物(CD133、Nestin、DCX、PSA-NCAM及TUC-4)的表达情况;用核增殖抗原Ki67 (MIB1)免疫组化染色法,观察原发髓母细胞瘤及其复发后肿瘤细胞的增殖状态,并比较两者的区别;采用核增殖抗原Ki67和干细胞样标志物的免疫荧光双染法,观察髓母细胞瘤干细胞样细胞在肿瘤复发前后的增殖情况,并比较两者的差别。 XTT法分别检测无血清培养的未分选髓母细胞、CD133阳性和CD133阴性三组细胞的增殖情况,并绘制各组的生长曲线;6孔板克隆形成实验观察各组细胞的克隆形成率;PI法检测CD133阳性和CD133阴性细胞的细胞周期,比较两组细胞的周期分布特点;未分选的髓母细胞及分选后的CD133阳性和CD133阴性细胞分别予以体外照光,流式细胞仪检测照光后48小时未分选髓母细胞的CD133阳性细胞比率,并与照光前比较;XTT法分别检测CD133阳性和CD133阴性细胞照光后的增殖情况,绘制生长曲线并与照光前比较;6孔板克隆形成实验观察照光后CD133阳性和CD133阴性细胞的克隆形成率,并与照光前比较;PI法观察照光后24小时CD133阳性和CD133阴性细胞的细胞周期分布情况,并与照光前比较;Western Blot法检测照光前后CD133阳性和阴性细胞的周期蛋白表达情况,并比较它们之间的差异;AnnexinV流式检测法和彗星电泳法观察CD133阳性细胞照光前后的凋亡变化和DNA损伤修复情况,并与CD133阴性细胞群比较。 [结果] 细胞体外培养发现原代髓母细胞瘤在无血清培液中悬浮生长,呈神经球样细胞团,该群细胞中6%±0.58%的细胞能自我增殖,形成单细胞克隆球;D283无血清培养后也有悬浮生长的神经球样结构形成,其单克隆形成率为21.43%±1.69%。分选后的CD133阳性细胞在无血清培液中能形成悬浮肿瘤球,CD133阴性细胞大部分呈贴壁生长,无肿瘤球形成。CD133阳性细胞在NOD-SCID鼠皮下形成的继发肿瘤体外再次无血清培养后能形成悬浮肿瘤球,形态同原代髓母细胞。 流式细胞仪检测发现5例原代髓母细胞的CD133阳性比率均不高,最高为4.74%±0.48%,随着无血清培养时间的延长,其CD133阳性细胞比率开始呈上升趋势,以后保持不变;用含血清培液培养1周后,其CD133阳性比率均有不同程度的下降。血清培液中D283的CD133阳性比率在不同时间点维持不变,均在20%左右;D283无血清培养后,其不同时间点的CD133阳性比率均维持在17%左右。CD133阳性细胞所致继发肿瘤的CD133阳性比率同原代肿瘤细胞,CD133阴性细胞所致瘤的CD133阳性比率接近0;无血清培养的髓母细胞体外照光后24小时其CD133阳性率有所升高。 免疫荧光和免疫组化染色发现无血清培养的D283和原代髓母细胞可以表达多种干细胞标志物;髓母细胞瘤干细胞样细胞可以分为静息型和增殖型两种,且大都为静息型;原代髓母细胞血清诱导分化后可表达GFAP、β-tubulin和CNPase等分化标志物;D283用含血清培液培养后仍表达干细胞标志物,但不表达GFAP、β-tubulin和CNPase;分选后的CD133阳性细胞能表达其它神经干细胞标志物,CD133阳性细胞群也可分为静息型和增殖型两种;5例原发髓母细胞瘤及其复发肿瘤标本中均存在干细胞样标志物(包括CD133、Nestin、DCX、PSA-NCAM及TUC-4等)的表达,其中CD133和Nestin有特征性的表达区域,被成为“血管周围龛(perivascular nich)";原发髓母细胞瘤的CD133表达弱,复发后其CD133阳性率有所升高;5例原发髓母细胞瘤中Ki67均呈高表达(proliferative index10%),复发后Ki67仍为高表达(原位复发)或更高表达(远隔部位复发);人髓母细胞瘤中存在处于增殖状态的干细胞样细胞,并且复发后髓母细胞瘤干细胞样细胞的增殖性更强。 体内致瘤实验发现104及105个CD133阳性细胞能在NOD-SCID鼠皮下致瘤,H E染色提示继发肿瘤与原发肿瘤的组织学特征一致;107个CD133阴性细胞也能成瘤,但肿瘤体积较小生长较慢。 XTT法描绘细胞生长曲线时发现CD133阳性细胞在无血清培液中的生长速度较未分选髓母细胞和CD133阴性细胞快;CD133阳性细胞的增殖能力在3Gy照光后72小时内被抑制,但72小时后有所恢复。 6孔板克隆形成实验发现CD133阳性细胞的克隆形成率(32.56%±2.66%)高于未分选髓母细胞和CD133阴性细胞(分别为20.01%±1.49和5.89%±6.76%);CD133阳性细胞的克隆形成率在3Gy照光后仅有轻微的下降(从照光前的32.56%±2.66%下降到照光后的30.61%±0.93%)。 PI法细胞周期检测发现CD133阳性细胞的G0/G1期比例(61.50%±2.31%)高于CD133阴性细胞(54.72%±0.97%);照光后CD133阳性细胞的G0/G1期比例上升到了67.67%±3.34%。 Western Blot法检测细胞周期蛋白的表达情况时发现照光前Cyclin B在CD133阳性细胞中的表达量较低,照光后其表达量有显著增加。 流式细胞仪AnnexinV凋亡检测法发现3Gy照光后24小时CD133阳性细胞的凋亡细胞比例较CD133阴性细胞低(前者为2.33%±0.06%,后者达到了9.33%±1.16%)。 彗星电泳法(Comet assay)发现5Gy照光后48小时CD133阳性细胞的“彗星尾”大部分已经消失,CD133阴性细胞的拖尾现象仍存在。 [结论] 无血清培养的髓母细胞中存在干细胞样细胞,它们能形成悬浮肿瘤球、自我增殖、多向分化以及在NOD-SCID鼠皮下成瘤;CD133阳性的髓母细胞富集了髓母干细胞样细胞;髓母干细胞样细胞可分为静止群和活跃群,且静止群较多,这是干细胞样细胞难根治,易复发的原因之一;原代髓母细胞CD133阳性比率在无血清培养条件下开始呈上升趋势,含血清培养后又逐渐下降,说明干细胞因子及微环境对髓母干细胞样细胞的维持至关重要。原发和复发髓母细胞瘤中均有脑肿瘤干细胞样细胞的存在;髓母细胞瘤干细胞样细胞在肿瘤复发后表现出更强的增殖能力。CD133阳性髓母细胞具有较强的增殖能力;体外照光后CD133阳性细胞的强增殖性和克隆形成率相比CD133阴性细胞没有受到明显抑制,CD133阳性细胞具有放疗抵抗特性。其具体的机制可能与CD133阳性细胞照光后的细胞周期再分布,周期蛋白表达,抗凋亡和DNA损伤修复能力有关。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R739.4

知网文化
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 李茗初;邓永文;伍军;陈风华;刘劲芳;方加胜;;髓母细胞瘤中脑肿瘤干细胞的分离培养及鉴定[J];癌症;2006年02期
2 高建军,丰盛梅,金慰芳;碱性单细胞凝胶电泳铺胶技术的改进[J];复旦学报(医学版);2004年03期
3 季晓燕,黄强;神经干细胞和脑肿瘤干细胞与胶质瘤发生发展潜在性研究[J];实用肿瘤杂志;2005年04期
4 张燕,戴峰;细胞凋亡与肿瘤的放射治疗[J];医学理论与实践;2003年07期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 李莹杰,夏育竹,张艳梅,陈英准;髓母细胞瘤Ki67、c-erbB-2的表达分析[J];哈尔滨医科大学学报;2003年06期
2 张燕,苏长青,陶晨;放射线诱发Lewis肺癌细胞株凋亡的研究[J];实用癌症杂志;1999年03期
3 张燕,戴峰;细胞凋亡与肿瘤的放射治疗[J];医学理论与实践;2003年07期
4 梁秋娟,涂自智,肖献忠;从细胞凋亡看生命的选择[J];医学与哲学;2004年06期
5 尹昌林;杨辉;;脑胶质瘤干细胞的研究进展及应用前景[J];中国微侵袭神经外科杂志;2006年08期
6 汤旭群;毛颖;;脑肿瘤干细胞[J];中国微侵袭神经外科杂志;2006年12期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 蒋满荣;DNA 损伤对哺乳动物细胞周期和凋亡的影响[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
2 李松林;活血化瘀为主治疗骨髓增生异常综合征的研究[D];广州中医药大学;2001年
3 薛晓英;基因HDAC3、NRAGE和NF-kB与肿瘤细胞放射抵抗性的关系以及TSA对食管癌细胞的放射增敏作用[D];河北医科大学;2005年
4 吕长兴;预测人体肿瘤细胞放射敏感性的方法学研究[D];中国协和医科大学;1999年
5 赵铭;~(99m)Tc-HL91乏氧显像评价恶性脑肿瘤放疗疗效的实验和临床研究[D];华中科技大学;2006年
6 毕长龙;脑肿瘤干细胞的多药耐药性及其机理研究[D];中南大学;2007年
7 孙志刚;食管肿瘤干细胞分离及生物学性状的初步研究[D];第二军医大学;2007年
8 尹昌林;SHH信号通路对脑胶质瘤干细胞增殖与分化调控作用的实验研究[D];第三军医大学;2007年
9 肖其华;TIMP-2基因转染对C6胶质瘤干细胞生物学特性的影响[D];四川大学;2007年
10 沈罡;脑胶质细胞瘤肿瘤干细胞的分离、鉴定以及生物学特性研究[D];浙江大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张朋;c-Myc表达下调是与髓母细胞瘤细胞周期阻滞和凋亡密切相关的分子事件[D];大连医科大学;2006年
2 卢靖;三氧化二砷(As_2O_3)对人脑胶质瘤U251细胞凋亡及c-myc癌基因表达的影响[D];福建医科大学;2006年
3 何欣;豆类丝核菌次级代谢产物的遗传毒性与致突变性研究[D];西北农林科技大学;2006年
4 刘继东;ABCG2、CD_(133)在人脑胶质瘤中的表达及意义[D];昆明医学院;2006年
5 王昆鹏;人脑胶质瘤干细胞的分离、培养及初步鉴定的实验研究[D];昆明医学院;2007年
6 张海涛;基因(上皮膜蛋白1)在人脑胶质瘤中的表达研究[D];第二军医大学;2007年
7 陈帅;人脑胶质瘤U251细胞系中脑肿瘤干细胞的免疫磁珠分选与凋亡研究[D];中南大学;2007年
8 郝禄贵;改良彗星试验检测兔死后肝细胞核DNA含量变化及其法医学意义[D];重庆医科大学;2007年
9 王静;恶性胶质瘤细胞系的建立及其肿瘤干细胞生物学特性的初步研究[D];四川大学;2007年
10 胡少辉;肝细胞肝癌中Skp2、C-myc和P27蛋白的表达及其相关性[D];华中科技大学;2006年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 巢卫,彭祥鄂;人体肿瘤干细胞软琼脂集落培养——Ⅱ 双层琼脂法[J];癌症;1987年01期
2 赵卫红,陈家佩,从玉文,吴岚军;咖啡因促进受照肿瘤细胞凋亡的研究[J];癌症;1999年04期
3 张遵真,衡正昌,李蕊,谭宗庆;单细胞凝胶电泳试验的最适条件研究[J];卫生毒理学杂志;1998年04期
4 张美琴!200032,蔡树模!200032,施达仁!200032,陆洪芬!200032;放射诱导细胞凋亡与子宫颈癌放射敏感性的关系[J];中华妇产科杂志;1999年12期
5 吴玮,孔宪涛,杨如俊,李莉,闵锐,张玲珍,施笑梅,周炳荣;小鼠受亚致死剂量~(60)Co γ 射线照射后胸腺细胞凋亡的研究[J];中华放射医学与防护杂志;1998年02期
6 黄强;胶质瘤起源细胞探讨[J];中国微侵袭神经外科杂志;2003年08期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张福林,刘健,黄抗美,曹世龙;髓母细胞瘤的临床病理观察与DNA含量分析[J];中国临床神经科学;1994年01期
2 付学玲;髓母细胞瘤14例术后放疗的远期观察[J];徐州医学院学报;1997年03期
3 甄文春,王成敏,任立红;脑髓母细胞瘤误诊结核性脑膜炎1例[J];哈尔滨医科大学学报;1998年05期
4 李灵敏,冀春萱;小脑髓母细胞瘤的形态学观察[J];临床与实验病理学杂志;2001年05期
5 徐辉,罗定泰,沈建三;髓母细胞瘤的术后治疗分析[J];肿瘤研究与临床;2002年04期
6 江荣才,浦佩玉,申长虹,于士柱,焦宝华,王虎,王春艳,康春生;应用微阵列初步分析髓母细胞瘤的基因表达谱[J];中华医学遗传学杂志;2004年02期
7 刘彩侠;王智;;儿童髓母细胞瘤的MRI诊断[J];科技成果纵横;2008年06期
8 赵学林;王可耕;李建民;丰玉功;;幕上髓母细胞瘤1例报告[J];滨州医学院学报;1990年02期
9 叶劲;;髓母细胞瘤16例临床分析[J];广州医药;1992年01期
10 张良,杨开勇,蔡博文;56例儿童后颅凹髓母细胞瘤的诊断与治疗[J];河南诊断与治疗杂志;1999年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王福科;刘流;赵德萍;代晓明;李逸松;何晓光;;脂肪干细胞培养中一种特异细胞的鉴定分析[A];第七届中国医师协会美容与整形医师大会论文集[C];2010年
2 张燕;张永琴;刘静;史璐;雷晓萍;;一例儿童髓母细胞瘤围手术期护理[A];中华护理学会全国肿瘤护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2010年
3 孙雅静;于士柱;孙翠云;王虔;金树梅;吴伟翔;安同岭;;髓母细胞瘤染色体DNA失衡的比较基因组杂交研究[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年
4 李佳宁;傅宏亮;王辉;;髓母细胞瘤多发骨转移骨显像随访的回顾性分析一例[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
5 李强;郭学平;;透明质酸应用于干细胞培养的研究进展[A];2011中国(威海)干细胞与组织工程治疗前沿论坛论文集[C];2011年
6 王福科;刘流;赵德萍;代晓明;李逸松;李宗芳;;大鼠脂肪干细胞培养中一种特异细胞的表型和成骨诱导分析[A];第八次全国口腔颌面—头颈肿瘤会议论文汇编[C];2009年
7 朱斌;胡官霞;夏之柏;;miR-130a在髓母细胞瘤中表达下调及功能预测[A];江苏省遗传学会第八届会员代表大会暨学术研讨会论文集[C];2010年
8 刘巧丹;夏云飞;;放疗在原始神经外胚叶瘤/髓母细胞瘤中的作用[A];中华医学会放射肿瘤治疗学分会六届二次暨中国抗癌协会肿瘤放疗专业委员会二届二次学术会议论文集[C];2009年
9 黄欣;沈宏;朱永坚;徐锦芳;;43例髓母细胞瘤的治疗体会[A];2007浙江省神经外科学学术年会论文汇编[C];2007年
10 钟秀珍;陈丽欢;邓丽芳;;一例小儿后颅窝巨大髓母细胞瘤切除手术护理配合[A];创建患者安全文化——中华护理学会第15届全国手术室护理学术交流会议论文汇编(中册)[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;黑龙江干细胞培养传代技术渐趋成熟[N];中国高新技术产业导报;2001年
2 记者 郑颖璠 吴刚;我国干细胞临床应用指日可待[N];健康报;2010年
3 记者 任诗芹 通讯员 吴鹏伟;自体角膜缘干细胞培养移植成功[N];安徽日报;2006年
4 陈丹;软凝胶基质代替硬培养皿成为干细胞培养新方法[N];科技日报;2010年
5 张可喜;用自身干细胞培养角膜[N];中国知识产权报;2001年
6 记者 何德功;干细胞培养角膜上皮[N];新华每日电讯;2004年
7 ;静脉化疗治复发性髓母细胞瘤[N];中国医药报;2003年
8 ;人类胚胎干细胞培养“安全”了[N];医药经济报;2005年
9 张如;干细胞移植修复受损神经曙光初现[N];消费日报;2008年
10 葛秋芳;英国科学家首次用干细胞培养出心脏瓣膜[N];医药经济报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 汤旭群;人髓母细胞瘤干细胞样细胞的分离鉴定及放疗对其增殖影响的体外实验研究[D];复旦大学;2010年
2 付元山;髓母细胞瘤对维甲酸敏感性差异的内在分子机制分析[D];大连医科大学;2010年
3 谢雪微;大鼠脂肪干细胞复合水凝胶体外多分化能力的实验研究[D];华中科技大学;2010年
4 叶小群;肺癌干细胞的分离鉴定及线粒体能量代谢特性的研究[D];第三军医大学;2011年
5 周憑;Th17细胞和人髓母细胞瘤的实验研究[D];复旦大学;2010年
6 李文臣;髓母细胞瘤与室管膜瘤患者脑脊液比较蛋白质组学研究[D];吉林大学;2011年
7 刘娜;炎症微环境影响下Wnt信号通路对牙周膜干细胞骨向分化的调控机制研究[D];第三军医大学;2011年
8 邹康;小鼠雌性生殖干细胞的分离、建系及功能研究[D];上海交通大学;2011年
9 吕长荣;诱导成年牛皮肤成纤维细胞为多能性干细胞的研究[D];西北农林科技大学;2011年
10 陈保东;RNA干扰Racl基因对髓母细胞瘤细胞生物学行为影响的实验研究[D];南方医科大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 吴大号;髓母细胞瘤的综合诊治分析和改良手术[D];山东大学;2012年
2 刘恿铂;2型糖尿病大鼠脂肪来源干细胞功能的研究[D];南京大学;2013年
3 路平;人子宫内膜干细胞体外分离、培养及鉴定[D];郑州大学;2011年
4 胡峰;诱导分化降低胶质瘤干细胞样细胞表型及其致瘤性[D];华中科技大学;2011年
5 许其军;人脂肪来源干细胞上清液对裸鼠皮肤创面愈合的影响[D];华中科技大学;2012年
6 潘新;P73在髓母细胞瘤中的表达及意义[D];中国医科大学;2002年
7 姚超;基于小鼠模型的两种组织干细胞的相关研究[D];中国协和医科大学;2010年
8 沙德潜;盐酸法舒地尔促进脂肪干细胞体外诱导为表皮样细胞的实验研究[D];河北医科大学;2010年
9 李晏;超顺磁氧化铁标记对大鼠脂肪干细胞向肝样细胞诱导分化的影响[D];南方医科大学;2010年
10 王祝迁;大鼠毛囊干细胞的分离培养和鉴定方法研究[D];新疆医科大学;2011年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026