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《复旦大学》 2010年
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G蛋白偶联受体激酶在胚胎发育中调控作用的研究

蒋晞  
【摘要】: G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)是细胞表面最大的一类受体超家族,它能够介导多种多样的配体信号,包括激素、神经递质、气味及其它小分子,调节广泛的生理功能和药物作用,同时也是多种疾病临床治疗的靶点。G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases, GRKs)是调节GPCR的一类关键的丝/苏氨酸激酶。它能够特异性结合被激动剂激活的受体,迅速磷酸化受体的胞内段,抑制受体的持续激活,介导受体内吞和脱敏。GRK有七种亚型(GRK1-7),分为三个亚家族。其中研究较多的是GRK2和GRK5。这两类GRK广泛分布于全身多种器官,对多种GPCR具有选择性的调节作用,参与调节多种多样的生理现象和病理过程。GRK2和GRK5都拥有保守的催化结构域,同时也各有特点:GRK2是GRK家族中唯一一个基因缺失胚胎致死的成员,其作用机制尚不清楚;GRK5及其同亚家族成员因拥有一段核定位序列,而在细胞浆和细胞核均有分布,但其核内功能却尚未明确。 以往的研究主要集中在GRK2和GRK5对分化、发育成熟的机体、组织的调节功能上,GRK在胚胎发育过程中的作用还研究得较少。明确GRK这类生理功能、信号通路的关键调节蛋白在胚胎发育中的作用,将有助于指导胚胎期用药,并且对于防止胚胎发育异常有着重要意义。我们的研究以斑马鱼为模型,结合人类细胞上的机制探讨,主要揭示GRK2和GRK5对胚胎发育的调控作用。研究发现: 1、GRK2和GRK5在斑马鱼胚胎发育早期都有高表达;在斑马鱼胚胎中分别下调GRK2和GRK5,都会引起胚胎发育的缺陷。其中,GRK2下调引起胚胎早期发育迟滞和细胞周期G2/M期停滞;GRK5下调主要影响正常的胚胎造血。不仅过表达野生型的GRK2或GRK5能够缓解内源蛋白下调导致的发育缺陷,其激酶活性缺失的突变体K220R和K215R也有明显的缓解作用,提示:GRK对于胚胎早期发育的调控不依赖其激酶活性。 2、酵母双杂交结果提示,GRK2可以与cyclin B1调节蛋白PTCH1相互作用;基因芯片结果提示,GRK5可能对调节造血的转录因子GATA2有调节作用。细胞实验证明,GRK2与PTCH1之间、GRK5与GATA2之间确实存在相互作用;并且通过免疫共沉淀筛查,找出了各自的结合位点。实验发现,包含GRK2与PTCH1结合位点的小片段BP对GRK2下调引起的胚胎早期发育迟滞和细胞周期G2/M期停滞均有明显的缓解作用,而结合功能缺失的突变体△312-379则没有这种效应;GRK5与GATA2结合功能缺失的点突变R216L不能缓解GRK5下调所引起的造血功能障碍,其包含结合位点的小片段M130甚至还有显性失活突变体的作用。提示,GRK2与GRK5分别通过结合PTCH1和GATA2调节胚胎发育。 3、PTCH1的激动剂Hedgehog (ShhN)刺激促进GRK2结合PTCH1,减弱cyclinB1与PTCH1的相互作用。GRK2、K220R和BP都能促使cyclin B1与PTCH1解离,促进cyclin B1从细胞浆进入细胞核,而△312-379则不能。提示,GRK2通过与PTCH1相互作用,促使cyclin B1与PTCH1解离,促进cyclin B1回到细胞核内调节细胞周期、细胞增殖和胚胎发育。 4、GRK5、K215R以及GRK2核定位的突变体NLS-GRK2均能促进GATA2在细胞核内积聚,并且增强GATA2的转录活性;而R216L和核定位缺陷的GRK5突变体NES-GRK5则不能。提示,GRK5主要通过结合GATA2,在核内积聚GATA2,促进GATA2的转录功能。 综上所述,我们的研究发现了GRK2和GRK5在胚胎发育过程中、与成体不同的重要调节作用,探讨了两者各自的调节机制。其中,GRK2主要通过直接结合cyclin B1的调节蛋白PTCH1,从而促使cyclin B1与PTCH1解离,增加cyclinB1入核,促进cyclin B1介导的细胞周期和胚胎发育;GRK5则通过结合GATA2,使GATA2在核内积聚,增强GATA2的转录活性,促进造血干细胞的分化成熟和胚胎造血。我们的研究揭示了GRK在胚胎发育方面新的调节功能和激酶活性非依赖的调节通路。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R321

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【参考文献】
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