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《复旦大学》 2010年
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儿童呼吸道感染病原学及肺炎链球菌耐药的分子流行病学研究

陈蓉  
【摘要】: [背景] 急性呼吸道感染(Acute Respiratory Infection, ARI)是婴幼儿时期的常见病、多发病,同时也有着很高的病死率,给家庭和社会带来了严重的负担。因此了解ARI病原学的组成及危险因素,可以用以指导临床治疗,从而有效地降低急性呼吸道感染的发病率和病死率。 肺炎链球菌作为急性呼吸道感染主要的条件致病菌,是引起全球所有年龄组高发病率和高死亡率的主要病原菌之一,尤其是3岁以下的婴幼儿。但是日益增多的多重耐药性给临床治疗和疾病预防带来了更大的挑战,因此了解肺炎链球菌感染的影响因素及其耐药性显得尤为重要。 耐大环内酯类肺炎链球菌(Macrolide Resistant Streptococcus Pneumoniae, MRSP)已成为我国肺炎链球菌感染治疗中最为严重的问题,对MRSP耐药状况和耐药机制的准确掌握是有效治疗临床肺炎链球菌感染、控制耐药性播散的前提和基础。由于不同地区耐药状况和耐药机制有一定的差异,因此迫切需要对MRSP进行深入的分子流行病学的研究。 [目的] 了解住院患儿呼吸道感染的病原学及其影响因素,研究肺炎链球菌的耐药情况以及耐药性的传播模式,为有效降低呼吸道感染,尤其是耐药肺炎链球菌感染导致的发病和死亡提供科学依据。具体目的包括: 1.利用以医院为基础的监测中收集的现场调查资料和痰标本,分析儿童呼吸道感染的病原学及其影响因素; 2.分析肺炎链球菌感染的危险因素,对监测期间收集的肺炎链球菌菌株进行耐药分析,分析菌株的耐药情况和多重耐药模式; 3.研究耐大环内酯类抗生素肺炎链球菌的耐药表型和耐药基因型,结合流行病学资料了解耐药菌株的传播方式,追踪耐药株的起源和进化路径。 [方法] 在苏州大学附属儿童医院进行为期一年的3岁以下儿童呼吸道感染的监测,共收集2006年3月-2007年3月确诊的3岁以下呼吸道感染病例453例,对每位研究对象进行相关流行病学问卷调查(患儿的基本情况、既往病史、社会人口学资料、抗生素使用史等)和采集痰标本进行细菌培养和病毒鉴定。比值比(Odds Ratio, OR)和95%可信区间(Confidence Interval, CI)的计算采用Logistic回归模型,用以分析不同病原感染的影响因素。 利用Logistic回归模型分析肺炎链球菌感染的危险因素,同时对分离到的60株肺炎链球菌菌株进行耐药性分析,采用K-B纸片药敏试验检测对苯唑青霉素、红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明、氧氟沙星、氯霉素、万古霉素、利福平等9种抗生素的敏感性,采用E-test药敏试验检测对5种抗生素(青霉素G、红霉素、阿莫西林、头孢呋辛、头孢曲松)的敏感性,采用卡方检验对肺炎链球菌感染的可能的影响因素进行单因素分析。 采用双纸片法检测分离到的耐大环内酯类肺炎链球菌(MRSP)菌株的耐药表型,利用PCR对其进行耐药基因ermB和mefE的检测,分析耐药表型与耐药基因型的关系,同时采取多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)技术分析其耐药性的传播方式,了解耐药克隆的遗传背景,追踪耐药株的起源和进化路径。 [结果] 3岁以下急性呼吸道感染的住院患儿以肺炎感染为主,占71.7%,其次是上呼吸道感染(Acute Upper Respiratory Infection, AURI),为14.3%。肺炎和AURI多发生于1岁及以下的儿童;春季入院的患儿最多,而秋冬季相对较少。89.6%的患儿入院前一周内使用过抗生素,其中使用最多的两类抗生素依次为β-内酰胺类和大环内酯类,在应用过抗生素的患儿中其使用率分别为88.2%和20.4%。 453例患儿中,细菌、病毒总阳性率为48.6%,其中单纯病毒感染32例(7.1%),单纯细菌感染161例(35.5%),细菌病毒合并感染27例(6.0%)。细菌感染以流感嗜血杆菌(17.0%)、肺炎链球菌(13.2%)为主,病毒以呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)和腺病毒(Adenovirus, ADV)为主。不同疾病的病原谱也略有差异。AURI患儿以流感嗜血杆菌(16.9%)、卡他布兰汉菌(7.7%)、肺炎链球菌(6.2%)感染为主,合并感染较少,均为ADV合并细菌感染;肺炎患儿以流感嗜血杆菌(16.3%)、肺炎链球菌(14.5%)、RSV(7.2%)感染为主,合并感染以RSV和肺炎链球菌为主;其他下呼吸道感染患儿则以流感嗜血杆菌(20.6%)、肺炎链球菌(14.3%)、RSV(8.3%)感染为主,合并感染较少。此外本研究还发现白色念珠菌和肺炎克氏菌等其他病原菌。 多因素分析显示,不同年龄、季节的患儿病毒阳性率不同,冬季入院的患儿病毒阳性率最高(春季/冬季:OR=0.417,95%CI:0.184-0.948;夏季/冬季:OR=0.135,95%CI:0.048-0.376;秋季/冬季:OR=0.126,95%CI:0.037-0.430).1岁以上儿童的病毒阳性率要高于l岁及以下的儿童(OR=2.094,95%CI:1.135-3.866)。不同的病毒的阳性率在季节和年龄分布上也有差异。RSV在冬季的阳性率最高(26.4%);ADV在春季的阳性率最高(6.1%),而且ADV的阳性率随着年龄的增加而增高。Inf-A在1-2岁的患儿中阳性率最高(4.2%),在春秋季未发现Inf-A阳性患儿。Inf-B和Pinf-1均只在春季入院的、1岁及以下的患儿中检出。 研究显示细菌总体阳性率与季节有关。春季和夏季细菌阳性率低于冬季,而秋季和冬季的阳性率没有区别(春季/冬季:OR=0.419,95%CI:0.204-0.862;夏季/冬季:OR=0.336,95%CI:0.160-0.706;秋季/冬季:OR=0.780,95%CI:0.355-1.715)。不同细菌在不同季节的阳性率也不同。流感杆菌多见于冬春季(P0.05):肺炎链球菌、副流感杆菌在冬季的阳性率明显高于其他季节(P0.05);金黄色葡萄球菌在秋季检出略多(P0.05);铜绿假单胞菌则多见于夏季(P0.05),而卡他布兰汉菌在各季节的阳性率未见明显差异。 453例患儿中,共60人检出肺炎链球菌,阳性率为13.2%。多因素分析显示患儿年龄和发病季节与肺炎链球菌的阳性率有关。1岁及以下的患儿的肺炎链球菌的阳性率要低于1岁以上的患儿(1岁及以下/l岁以上:OR=0.360,95%CI:0.184-0.704)。冬季肺炎链球菌的阳性率最高,其次是春季和秋季,夏季最低(春季/冬季:OR=0.338,95%CI:0.144-0.792;秋季/冬季:OR=0.284,95%CI:0.099-0.815;夏季/冬季:OR=0.218,95%CI:0.085-0.559).其他因素如抗生素使用与否、既往呼吸系统病史、居室内有无吸烟者、病毒检出与否对患儿肺炎链球菌阳性率均无影响(P0.05)。 肺炎链球菌的耐药率非常高,对红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明、青霉素、头孢呋辛、头孢曲松、氯霉素、阿莫西林的耐药率依次为100%、98.4%、96.7%、81.6%、60.4%、58.3%、13.3%、12.5%和2.1%。未发现氧氟沙星、利福平和万古霉素耐药菌株。48株菌株均对3种或3种以上的抗生素耐药,多重耐药率达100%。以青霉素+红霉素+四环素+克林霉素+复方新诺明+头孢呋辛多重耐药模式为主,其次是红霉素+四环素+克林霉素+复方新诺明。当肺炎链球菌对青霉素的敏感性不同时,对头孢呋辛的敏感性也不相同(P=0.000),但对其他抗生素的敏感性未发现显著性差异(P0.05)。青霉素敏感肺炎链球菌(Penicillin Susceptible Streptocococus Pneumniae, PSSP)多重耐药性主要表现为红霉素+四环素+克林霉素+复方新诺明耐药,而青霉素耐药肺炎链球菌(Penicillin Resistant Streptocococus Pneumniae, PRSP)则以红霉素+四环素+克林霉素+复方新诺明+头孢呋辛多重耐药为主。 48株临床分离的MRSP菌株的双纸片法检测结果显示,43(89.6%)株为cMLSb型,4(8.3%)株为iMLSb型,1(2.1%)株为M型。23株(47.9%)菌株仅检测出ermB基因,24株(50.0%)菌株同时检测出mefE基因和ermB基因,1株(2.1%)菌株仅检测出mefE基因。1株仅检测出mefE基因的菌株表现为M型,23株仅检测出ermB基因的菌株均表现为MLSb耐药,以cMLSb耐药表型为主。24株同时检测出mef和ermB基因的菌株均表现为cMLSb耐药表型。 MLST法共检测出16株新的序列型,其中1株(ST4643)发现了新的位点基因gki237,而其他15株未发现新的位点基因,是已知7个位点基因的新组合所致(ST4628-4642),而且各个新序列型只有l株菌株。应用eBURST V3软件分析显示,46株耐红霉素肺炎链球菌共分为2个克隆复合体(CC271、CC876)和22个单一克隆菌株(singleton)。本研究共发现29株PMEN国际流行克隆株,依次为17株Taiwan19F-14、5株Netherlands15B-37、1株USANT-43、l株Spain9V-3、2株Netherlands3-31、1株Taiwan23F-15、l株England14-9和1株Spain6B-2,占分离到的MRSP的63%。 PMEN克隆菌株与非PMEN克隆菌株对青霉素、头孢呋辛的耐药率有统计学差异(P0.05)。PMEN克隆株以ermB和mefE基因共同介导为主,而非PMEN克隆株则以ermB基因介导为主。本研究未发现年龄、抗生素使用史等对PMEN菌株感染的影响。 【结论】 急性呼吸道感染以肺炎为主:病原学以细菌为主,流感嗜血杆菌和肺炎链球菌仍然是最主要的细菌病原;冬季入院的患儿细菌阳性率最高,不同种类的细菌在不同季节的阳性率也不尽相同;肺炎链球菌的耐药率非常高,且呈多重耐药模式,应规范临床经验性治疗的用药;耐药菌株的克隆播散和耐药基因的水平传播共同导致了本地区肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的高度耐药,需进一步加强对国际流行克隆的监测。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R446.5

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