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《复旦大学》 2010年
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痔血胶囊组方肝毒性的实验研究

倪晓珺  
【摘要】: 痔血胶囊是一种纯中药复方制剂,由苦参和白鲜皮两味中药组成,主治Ⅰ、Ⅱ期内痔所致的便血、肛门坠涨或坠痛等症状。该药属中药6类新药,于2004年开发上市。组方的苦参(Radix Sophora flavescentis, Kushen)是豆科槐属植物苦参(Sophora flavescens Ait.)的干燥根,白鲜皮(Cortex Dictanmi, Baixianpi)是芸香科植物白鲜(Dictamnus dasycarpus Turcz.)的干燥根皮,两药皆为我国传统中药,味苦性寒,具有清热燥湿、祛风解毒的功效。其中白鲜皮为君药,加用苦参增强白鲜皮清热除湿的功效,从病因上治疗痔疮。 近年来国家不良反应监测中心不断收到痔血胶囊引起肝毒性的报告,报告数于2008年达到顶峰,最终该药于2008年11月由生产企业召回,但尚未撤出市场,其应用前景有待于它与肝毒性之间的因果关系评估。值得注意的是,苦参和白鲜皮两味中药均含有已知的“保肝”成分,由它们组方制成的痔血胶囊何以会造成肝脏损害机制不明。 为明确痔血胶囊与肝毒性之间的因果关系及可能的毒性成分,本课题先在离体水平从痔血胶囊组方中确定潜在的肝毒性药味,再在整体动物实验上验证肝毒性药味对肝功能和肝组织学形态的影响。进一步利用半制备HPLC分离技术遵循活性追踪分离的思路分离得到可能的肝毒性组分,确定其化学结构。 第一部分痔血胶囊组方中肝毒性药味的确定 目的在原代大鼠肝细胞模型上确定痔血胶囊组方中引起肝毒性的药味。 方法根据痔血胶囊专利制备实验用药,得到白鲜皮醇提物(以下简称“白鲜皮”,得率10.7%)、苦参醇提物(以下简称“苦参”,得率20.0%)及苦参白鲜皮复方醇提物(按痔血胶囊中两药配比,以下简称“复方”,得率12.5%)。苦参素和苦参碱为市售对照品。二步灌流法分离原代大鼠肝细胞,将上述药品分别作用于原代肝细胞一定时间,MTT方法检测肝细胞活力,比较不同药物的细胞毒性。结果孵育3h后,白鲜皮组(74-250μg/ml)与对照组的肝细胞活力无显著差异(P0.05),苦参111μg/ml、167μg/ml和250μg/ml组的肝细胞活力分别是对照组的101.6%、25.9%、9.7%,复方在74-250μg/ml浓度范围内与对照组细胞的活力无显著差异(P0.05)。苦参作用3h,6h,12h后抑制肝细胞活力的IC50分别是162.9(155.8-170.4),144.5(141.9-147.1),143.0(140.9-145.3)μg/ml。痔血胶囊主要有效成分苦参素和苦参碱在0.05-5 mM浓度范围内未见抑制肝细胞活力。 结论痔血胶囊组方中苦参具有肝细胞毒性,且呈现剂量和时间依赖性。同浓度下白鲜皮对肝细胞没有毒性作用。苦参素和苦参碱在较高浓度下也未见肝毒性。 第二部分苦参肝毒性的整体实验 目的研究苦参经不同给药途径对整体动物肝脏的影响。 方法将小鼠随机分为溶剂对照组和苦参50 mg/kg组,尾静脉注射给药。每天一次,连续7天,检测小鼠血清ALT和AST水平。将大鼠随机分为溶剂对照组、苦参2.5 g/kg组、5 g/kg组,灌胃给药,每天一次,连续7天,于第3天和第7天检测大鼠血清ALT和AST水平。大鼠肝组织切片经HE染色观察组织形态学变化。 结果静注给药7天后,苦参组小鼠血清ALT水平显著升高至对照组的1.33倍。灌胃给药3天后,2.5 g/kg和5 g/kg苦参组大鼠血清ALT水平升高至对照组的1.48倍和1.53倍。灌胃7天后,2.5 g/kg和5 g/kg苦参组大鼠血清ALT水平分别为对照组的1.43倍和1.60倍。肝组织病理检查显示,苦参组大鼠肝细胞明显肿胀,肝窦狭窄,肝细胞以水样变性为主,同时可见空泡变性。 结论苦参静注和灌胃给药可造成小鼠和大鼠肝损伤,表现为转氨酶升高和肝脏组织学变性。肝损伤严重程度没有随苦参给药时间的延长而有显著加重。 第三部分苦参中肝毒性组分的分离和表征 目的分离和鉴定苦参醇提物中的肝毒性化合物。 方法利用半制备HPLC方法分离并收集不同保留时间的组分:FR 1(12-17min)FR 2 (20-25min); FR 3 (26.5-31min); FR 4 (33-37min); FR 5 (38.5-40min); FR 6 (43-51mi); FR 7 (52-56.5min); FR 8 (60-64.5 min)。将各组分中的流动相挥干后称重,每个组分设立3个浓度(50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml),与原代大鼠肝细胞作用3 h,用MTT法测定细胞活力,比较各组分的肝毒性。重复收集强毒性组分中的主要峰,经MS、1H-NMR、13C-NMR确定结构,测定抑制肝细胞活力的IC50。 结果按出峰时间先后,组分FR1~FR8的极性依次递减,在浓度50μg/ml时8个组分作用3小时后,肝细胞活力分别为对照组的96.0%、102.3%、99.9%、86.1%、77.7%、112.5%、7.5%、21.1%。组分FR5、FR7和FR8组的肝细胞活力与正常组有显著差异(P0.05)。其中,FR 7和FR 8的肝细胞毒性明显大于其他6个组分。将FR7和FR8进一步分离后,从FR 7中得到苦参酮(kurarinone, Kur),从FR 8中分离得到槐属黄酮G (sophoraflavanone G, SFG)。两者在化学结构上都属于苦参异戊烯基黄酮,均表现出强烈的肝细胞毒性,Kur和SFG对原代大鼠肝细胞的IC50(95%可信限)分别为13.12(12.02-14.32)gg/ml和6.99(6.63-7.38)gg/ml。 结论苦参中的肝毒性成分主要位于低极性组分中。从FR7和FR8分离的苦参异戊烯基黄酮Kur和SFG具有很强的肝毒性,是导致苦参肝毒性的主要化合物。
【学位授予单位】:复旦大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285.5

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