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《上海交通大学》 2011年
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机械应力诱导血管内皮细胞和平滑肌细胞对内皮祖细胞滚动粘附及分化的影响

李玉青  
【摘要】:当血管损伤时,循环血液中的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)滚动粘附到损伤部位会与破损内膜层的内皮细胞(endothelial cells,ECs)和暴露的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)接触,受到ECs、VSMCs和血液动力学的影响,进而分化为ECs或VSMCs参与损伤血管的修复。EPCs需要经过多重步骤:动员,归巢,捕获,募集,滚动,粘附,迁移,分化等才能修复损伤内膜层。因此,研究EPCs的粘附和分化行为,应该考虑血流力学因素及邻近细胞ECs和VSMCs的影响,并具有重要意义。 本文采用密度梯度离心法和差异贴壁法从人脐血中获得EPCs,并以DiL-acLDL和UEA-lectin双色荧光法鉴定。用人脐静脉酶消化法和组织贴块法分别原代培养ECs和VSMCs。 应用玻璃管平行流动腔观测系统,其底部种植ECs,对EPCs施加0.1~0.4 dyn/cm2范围的切应力,记录切应力大小和ECs对EPCs滚动粘附速度的影响。再用TNFα(10 ng/ml)刺激处理ECs,6 h,Western Blot方法检测内皮粘附分子VCAM,ICAM,P-Selectin和E-Selectin的表达以及它们对EPCs滚动粘附速度的影响。 采用改进的细胞张应变加载系统,研究在5 % - 1.25 Hz牵拉ECs或VSMCs条件下对与它们隔开培养的EPCs分化的影响。采用荧光定量PCR技术检测细胞表面标志CD31、KDR、vWF和Calponin、α-actin、SM22α的RNA水平。Western blotting检测ECs标志蛋白VCAM,VSMCs标志蛋白Calponin、α-actin、SM22α的表达变化,同时也检测p-Akt、p-ERK和p-Sirt1信号蛋白分子的表达变化。 结果发现:①切应力可以增加被捕获EPCs的滚动速度,且具有正相关性;②ECs可以降低被捕获EPCs的滚动速度,TNFα处理ECs后可以显著增加ECs粘附分子VCAM、ICAM、P-Selectin和E-Selectin的表达,使EPCs的滚动速度降低;③ECs可以上调EPCs表达ECs标志蛋白VCAM,上调幅度为63.39 %,同时下调VSMCs标志蛋白α-actin和Calponin的表达,下降幅度分别为26.6 %和42.1 %;④VSMCs可以降低EPCs中ECs标志分子CD31、KDR和vWF的RNA分子水平,同时增加VSMCs标志分子Calponin和SM22α的RNA水平;⑤牵拉ECs可以降低EPCs中ECs标志分子CD31和vWF的RNA分子水平,增加VSMCs标志分子SM22α和Calponin的RNA含量;⑥牵拉VSMCs与否对EPCs表达的VCAM和α-actin没有显著性差异,CD31、vWF和SM22α、Calponin的RNA水平也没有明显变化;⑦ECs可以促进EPCs中信号蛋白分子p-Akt、p-ERK和p-Sirt1的表达,牵拉ECs则抑制p-Akt、p-ERK和p-Sirt1的表达;⑧VSMCs对EPCs中信号蛋白分子p-Akt、p-ERK和p-Sirt1的表达没有稳定影响,牵拉VSMCs可以降低EPCs中p-Akt和p-ERK的表达,但不影响p-Sirt1表达。 上述结果表明,ECs可能通过粘附分子与EPCs相互粘附,从而降低EPCs的滚动速度,TNFα可以增加这种粘附作用,从而更降低EPCs滚动速度;ECs能够促进EPCs向ECs分化,牵拉ECs则促进EPCs向VSMCs分化,静态VSMCs和牵拉VSMCs都促进EPCs向VSMCs分化,但牵拉与否差异不大;Akt、ERK和Sirt1信号通路可能参与了ECs诱导EPCs分化的过程,Akt、ERK与牵拉VSMCs诱导EPCs分化有关,而p-Sirt1则可能没有明显作用。
【学位授予单位】:上海交通大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q46

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