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抗肿瘤活性化合物灵芝酸T高效制备方法的研究

王家乐  
【摘要】:灵芝是一味名贵的中草药,在东亚地区有着数千年的药用历史。灵芝酸被证明是灵芝中一类主要的活性化合物,其具有抑制肿瘤成长和抗肿瘤转移等重要药理活性。随着灵芝菌丝体深层发酵技术及两阶段静置培养技术发展,原材料的供应已得到缓解,然而缺乏相对应的灵芝酸高效分离制备技术依旧阻碍并制约了对其深度药物研究和开发。目前,国内外尚未见关于高效、低成本特定灵芝酸单体制备工艺的报道,其主要难点在于特定灵芝酸在灵芝中的含量少、在色谱分离中分离度低、峰叠加情况严重。本学位论文利用两阶段静置培养技术得到灵芝菌丝体为材料探究了抗肿瘤活性化合物灵芝酸T的高效分离制备的策略,并建立了一套低成本、高得率、高纯度的灵芝酸T生产工艺模型。 本文从二阶段培养法生产的灵芝菌丝体中发现、分离并鉴定出一种新的灵芝酸化合物,根据习惯命名法将其称为7-乙氧基灵芝酸O。其在菌丝体内的含量为1.2-1.5 g/100 g干菌丝,为其他已鉴定灵芝酸的5-10倍,未见有更高含量的灵芝酸发现的报道。实验过程中,我们发现该灵芝酸可以通过酸解反应转化成灵芝酸T,因此可以作为灵芝酸T生产的前导化合物。 7-乙氧基灵芝酸O对于pH,高温及极性溶剂均不稳定,因此稳定性是分离制备该化合物中的核心问题。稳定性实验表明:7-乙氧基灵芝酸O在中性,非极性溶剂中稳定性最佳。通过实验分析,我们计算了7-乙氧基灵芝酸O在常用溶剂中40℃下的降解反应常数,并测算出其在甲醇,酸化甲醇(pH=5.1)及含水甲醇(20%含水量)的降解活化能分别为105.8±3.3 kJ/mol,38.2±3.6 kJ/mol,及103.2±2.4 kJ/mol。基于以上结论,我们设计由7-乙氧基灵芝酸O正相色谱分离,结晶提纯和酸解组成的高纯度灵芝酸T间接制备工艺。 同类物杂质的分离是天然产物及发酵产物制备的一大难题。在本文中,通过分析灵芝菌丝体内灵芝酸结构相关性,我们建立了一套针对灵芝酸T的预处理工艺,酸解-乙酰化-酸解。该策略可将大部分原本需要丢弃的灵芝酸转化为灵芝酸T,如7-乙氧基灵芝酸O和灵芝酸Mk,因此大大简化了粗提液中灵芝酸的种类,降低了后期分离纯化步骤的难度。经处理后,灵芝酸T在粗提液中的质量含量及与杂质的最小分离度分别从0.44 g/100 g干菌丝和1.05提升至1.69 g/100 g干菌丝和7.90,提升幅度分别约为4倍和7倍。将可转化为灵芝酸T的组分计入灵芝酸T的初始含量,整个预处理过程中灵芝酸T的回收率在90%左右。在实验室规模(78.5 mL柱体积)下,该方法便可将95%纯度的灵芝酸含量提升至每天2.9克。该策略解决了间接制备法需大量使用非极性溶剂的缺陷及在回收率等方面的不足。 本文克服了发酵液体系中目标产物含量小、分离度低、存在大量同类物杂质等困难,建立了灵芝酸T低成本,高纯度,高回收率的制备分离方法。本工作为灵芝酸T进一步的药物研究及临床开发提供了坚实的物质基础。本文的设计思路及相关经验可以为其他活性天然产物或发酵产物的制备分离提供参考。


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