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《上海交通大学》 2011年
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色素万寿菊psy双边界载体及遗传转化体系建立和SSR-PCR体系的优化

杨帆  
【摘要】:万寿菊(Tagetes erecta L.)不仅是重要的园林花卉,具有极高的观赏价值,而且花是提取叶黄素的优质材料,具有很高的经济价值。本研究以色素万寿菊雄性不育两用系为材料,根据gus基因瞬时表达的情况,建立根癌农杆菌介导的以万寿菊下胚轴为外植体的遗传转化体系,通过分子标记和PCR技术,对色素万寿菊雄性不育两用系的SSR-PCR体系进行优化,同时构建叶黄素代谢途径中关键酶基因psy的双边界表达载体,为获得高叶黄素含量的万寿菊转基因品种奠定基础,本研究结果如下: (1)建立了色素万寿菊雄性不育两用系遗传转化体系。 根据gus基因瞬时表达的情况,优化了遗传转化条件,建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。遗传转化的最佳条件为:外植体为下胚轴,预培养2d,农杆菌浓度OD600=1.0,1/2MS0悬浮,1/2MS0悬浮液和共培养培养基中AS浓度为100μmol/L,侵染采用80W、5min的超声波处理后,黑暗共培养2 d。 (2)构建了叶黄素生物合成途径中关键酶基因psy的双边界载体。 提取万寿菊花总RNA,RT-PCR获得cDNA,根据GenBank中万寿菊psy的编码序列设计特异引物,PCR扩增psy将其连接到双边界载体上,从而得到了植物表达载体,并采用“冻融法”将重组质粒转入农杆菌EHA105菌株中。 (3)对色素万寿菊雄性不育两用系的SSR-PCR体系进行优化。 以色素万寿菊雄性不育两用系为材料,通过对SSR-PCR反应体系中的主要因素dNTPs、引物及模板DNA进行最优条件筛选,建立了适合于色素万寿菊雄性不育两用系的SSR-PCR反应体系:2.5μl10×buffer、40 ng模板DNA、2μl 10μM/μl引物、1.0 U Taq酶、1.2μl2.5mM/μl dNTP,ddH2O补足体系至25μl;PCR循环程序为:94℃预变性2 min; 38个循环(94℃变性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸1min),72℃延伸10 min。
【学位授予单位】:上海交通大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S574

【参考文献】
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