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《上海交通大学》 2009年
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人类基因组复杂序列区域的扩增与测序策略研究

吕鸣  
【摘要】:虽然人类基因组计划已经于2004年宣布完成,但是已完成的人类基因组并不完美,这其中仍然存在着数百个大大小小的测序缺口,并且五年时间已经过去,这些问题依然还未解决。目前人们对这些测序缺口的特征认识还很有限,一般认为,它们通常都具有复杂的序列结构,从而导致对这些区域所进行的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)存在扩增效率低、扩增特异性差以及扩增产物难克隆等多重困难。现有的技术还无法解决这些问题,需要依赖于新的研究成果和技术突破。纳米粒子PCR作为一项新兴的纳米生物技术,具有传统的PCR优化方法所不具有的多重优化作用,对解决这类问题具有潜在的应用价值。 本文以人类基因组5号染色体上的一个测序缺口作为研究体系,通过结合纳米粒子PCR技术、DNA分子的原子力显微成像技术和巢式PCR、分子克隆等分子生物学方法,对该测序缺口进行扩增、测序及序列分析,并最终获得了完整的序列。 研究结果表明: 1.由于扩增体系过于复杂的原因,单独地采用纳米粒子PCR并不能起到有效的优化作用。但是将纳米粒子PCR同巢式PCR相结合,可以改善巢式PCR在扩增复杂序列区域时仍然存在的扩增效率和扩增特异性的不足。其中扩增特异性的提高还体现在扩增产物用于测序具有更高的测序质量。该特性对于我们获得该测序缺口的部分序列并作为进行下一步研究的基础起到了关键的作用。 2.该测序缺口中包含了一段特别复杂的区域,并导致: a.多对引物用于扩增这一区域都出现了扩增产物长度多态性; b.扩增产物中的一些片段克隆后的测序结果与克隆前不一致,测序结果长度要明显短于用于克隆的样品; c.完整地包含了这一区域的片段用于克隆效率很低; d.部分扩增产物还易形成十字型二级结构。对最终测序结果的序列分析也证实,该区域为一段同时富含正向重复和反向重复的序列,并且是这两类重复序列的共同作用导致了扩增易发生片段丢失和扩增产物长度多态性。这些发现解释了该测序缺口存在并难以解决的原因,对于我们进一步了解测序缺口的结构特征并发展更完善的基因组复杂序列区域的扩增与测序策略具有重要的参考价值。 作为人类基因组测序中最困难的部分,这其中还有许多问题有待解决。本论文综合多种纳米技术和生物技术提出了一种针对复杂序列扩增与测序的有效方法,部分解决了人类基因组测序缺口填补的难题。
【学位授予单位】:上海交通大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q78

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【参考文献】
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【共引文献】
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