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《上海交通大学》 2012年
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阿维菌素和安丝菌素生物合成相关基因的功能研究

邱竞帆  
【摘要】:阿维菌素是由阿维链霉菌(Streptomyces avermtilis)产生的16元大环内酯类抗生素。它具有高效、广谱的抗各种线虫和人类寄生虫的活性,被广泛地用于农业和畜牧业的病虫害防治。 avtAB(sav_933、sav_934)是紧邻阿维菌素生物合成基因簇的两个基因,它们分别编码ABC转运蛋白的ATP结合亚基(AvtA)和跨膜亚基(AvtB)。根据生物信息学的分析,AvtAB极有可能与阿维菌素的外排相关。本研究构建了avtAB的缺失突变株,发现avtAB的缺失并不能影响阿维菌素的产量。但以野生型菌株NRRL8165和工业菌株3-115作为出发菌株构建avtAB高表达菌株,固体发酵时阿维菌素的产量约有一倍左右的提高。 avtAB工业高拷贝菌株(3-115/pJTU3470)在工业液体培养基中发酵时,阿维菌素B1a的产量约有50%的提高,可从3.3g/L提高到4.8g/L。利用YMG液体培养基定量分析胞内胞外阿维菌素产量的变化,结果发现avtAB拷贝数的增加使得胞内与胞外阿维菌素B1a的比例从6:1下降到4.5:1。利用Real-time RT-PCR的方法定量分析ABC转运蛋白基因avtAB、结构基因aveA3和调节基因aveR在avtAB高拷贝菌株中的转录水平,发现avtAB的转录量提高了30-500倍,而aveA3和aveR的转录量却没有明显变化。这说明avtAB高表达提高阿维菌素的产量是通过及时将其泵出胞外,以减少胞内的反馈抑制,而不是在转录水平激活结构基因和调节基因的表达。此外我们还发现,AvtAB对于阿维菌素具有底物专一性,avtAB的高表达并没有影响阿维链霉菌中另一种抗生素寡霉素的外排;对链霉菌ABC药物转运蛋白进行进化分析,发现AvtAB与天蓝色链霉菌产生的钙依赖抗生素(CDA)的外排蛋白同源性极高,但在天蓝色链霉菌中高表达avtAB并没有明显提高CDA的产量。 aveE基因位于阿维菌素生物合成基因簇的内部,它编码P450单加氧酶,推测其负责催化阿维菌素后修饰的第一步反应——C6-C8a位的呋喃环闭合。为了阐明AveE的功能,深入研究AveE的作用机制,我们首先构建了aveE基因中断突变株,从中分离到了AveE体外催化底物。我们还构建了aveE回补菌株和meiE异源回补菌株,发现aveE和meiE只能恢复阿维菌素A组分,并不能恢复阿维菌素B组分的产生,暗示AveE可能还具有脱去阿维菌素C5位甲基的功能。在获得AveE可溶蛋白后,我们进行了体外反应尝试,并检测到了反应的发生,从体外的角度初步证明了AveE具有催化呋喃环形成的功能。 聚酮化合物中常会出现双键位置发生转移的现象,即双键的位置从两个延伸单位相邻两个碳原子之间(α-β位)转移到了前一个延伸单位的两个碳原子之间(β-γ位)。安丝菌素是从珍贵束丝放线菌橙色变种(Actinosynnema pretiosum ssp. auranticum)ATCC31565中分离到的安莎类抗生素。安丝菌素生物合成的第2和第3个模块中的脱水酶结构域(AsmDH2、AsmDH3)所对应催化的双键都发生了α-β位向β-γ位转换的现象。本研究通过定点突变失活了AsmDH2和AsmDH3,但定点突变株不能积累安丝菌素的完整延伸产物,说明下游酮脂酰-ACP-合成酶(KS)具有严格的底物严谨性,不能催化非天然的三酮或四酮中间产物。另外,我们还构建了将红霉素硫酯酶(EryTE)基因融合加载在安丝菌素模块2之后的突变株,结果显示EryTE并不能高效释放三酮中间产物,安丝菌素中间产物的体内捕获具有一定的难度。体外表达安丝菌素模块2,将约200kDa的可溶蛋白与安丝菌素天然二酮中间产物的类似物甲基氢肉桂酸-SNAC进行反应,得到了甲基氢肉桂酸等反应产物,证明该蛋白具有一定的催化活性。
【学位授予单位】:上海交通大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:Q933

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【参考文献】
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