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荧光纳米探针及诱导多能干细胞的制备与在胃癌靶向成像与治疗中的应用研究

阮静  
【摘要】:在中国,胃癌发病率位于第二位,死亡率位于第三位。全球每年新发胃癌100余万,死亡约80万,中国每年新发胃癌占全球的42%,死亡占35%,其发病率和死亡率均是世界平均水平两倍多。胃癌起源于胃壁最表层的粘膜上皮细胞,可发生于胃的各个部位,可侵犯胃壁的不同深度和广度,癌灶局限在粘膜内或粘膜下层的称为早期胃癌。早期胃癌经足够的治疗后90%以上患者能生存5年以上或治愈,晚期胃癌患者治疗后5年生存率不足5%。因此,早发现是改善疗效、提高生存率的关键,但是我国胃癌患者在确诊时为早期者仅占10%以下。所以,胃癌的早期诊断与治疗是提高胃癌患者预后的关键。纳米技术和干细胞技术是继手术、化疗和放疗之外新兴的治疗肿瘤的新技术,充分利用这两种技术的优势,不但可以发现体内胃癌,而且可以同时实现肿瘤的靶向治疗,从而提高早期胃癌的诊断率和增强治疗效果。 本论文结合现代分子影像技术和分子靶向技术,制备了荧光纳米探针和诱导多能干细胞,并探索了在胃癌靶向诊疗中应用的可行性,主要研究工作包括以下四个方面: (1)通过反微乳液法制备荧光磁性纳米粒子,采用MTT、蛋白质印迹和病理组织分析等方法评价了荧光磁性纳米粒子的生物安全性,通过共价键偶联胃癌组织高表达的分子标志物BRCAA1的单克隆抗体制备出荧光磁性纳米探针,利用分子影像技术、免疫荧光技术和等离子体质谱技术共同表征纳米探针在体内的分布及靶向胃癌能力。结果表明:荧光磁性纳米粒子具有良好荧光性能和磁响应性能,对细胞的毒性剂量为50μg/mL,对小鼠的毒性剂量为5mg/kg bw,在毒性剂量范围内FMNPs具有良好的生物相容性;制备的荧光磁性纳米探针通过尾静脉注射后在1h内可靶向到体内直径为5mm大小的皮下肿瘤组织处,6h后在肿瘤组织处达到信号峰值;该纳米探针对胃癌具有良好的靶向特异性和检测灵敏度,为胃癌的早期检测和诊断奠定基础。 (2)采用生物分子RNase A作为模板辅助合成荧光量子点,通过共价键偶联胃癌组织高表达的分子标志物HER2单克隆抗体制备出量子点探针,通过原位移植肿瘤组织块的方法建立生物发光的胃癌原位移植模型,利用活体荧光成像观察纳米探针在模型鼠体内的分布,并通过生物发光成像检测模型鼠原位胃癌的生长情况,最后提出纳米探针抑制肿瘤生长的机理。结果表明:制备的量子点探针在体内主要分布在肿瘤组织、肝部和肺部,该探针对原位胃癌组织具有显著的靶向特异性和检测灵敏度,在尾静脉注射后6h就可以清楚地在直径2mm左右的肿瘤组织处检测到荧光信号;并且该纳米探针可以显著地抑制肿瘤的生长,延长小鼠的生存时间,其可能的抑制机理是RNase A破环细胞的mRNA,阻断蛋白的表达,从而诱导肿瘤细胞的凋亡。该探针在诊断和治疗早期胃癌研究中具有应用前景。 (3)利用近红外荧光染料DiR标记小鼠胚胎干细胞,通过活体成像系统观察小鼠胚胎干细胞在荷瘤小鼠体内的分布,通过组织免疫荧光和蛋白质印迹技术验证小鼠胚胎干细胞靶向胃癌组织的能力,并通过流式细胞分析实验,ELISA实验和细胞穿膜实验提出小鼠胚胎干细胞靶向胃癌的可能性机理。结果显示:小鼠胚胎干细胞在尾静脉注射进入荷瘤小鼠体内10min后就可以识别出胃癌组织,2h后在胃癌组织中聚集的细胞量达到峰值;小鼠胚胎干细胞迁移胃癌组织的可能性机理是胃癌组织周围分泌趋化因子CXCL12,从而诱导表达CXCR4的小鼠胚胎干细胞向肿瘤组织趋化运动。mES细胞靶向体内胃癌的现象为利用干细胞诊断和治疗胃癌提供新的研究方向。 (4)建立人诱导多能干细胞系,利用已制备的荧光磁性纳米粒子标记人诱导多能干细胞制备出干细胞纳米探针,通过荧光成像系统观察干细胞纳米探针在荷瘤小鼠体内示踪胃癌的能力,并在63kHz,7kA/m的外加交变磁场作用下,通过量取肿瘤的体积评价干细胞纳米探针抑制肿瘤细胞生长的情况。结果显示:通过慢病毒载体递送Oct4、Sox2、Nanog和Lin28因子,成功地诱导HDF细胞重组为人诱导多能干细胞;利用荧光磁性纳米粒子标记人诱导多能干细胞成功制备了具有良好荧光性能的干细胞纳米探针;制备的干细胞纳米探针具有好的靶向识别胃癌的能力;干细胞纳米探针主要分布在体内的肿瘤组织和肝部,并且随着注射时间的增加,肿瘤组织的荧光信号越来越强;在外加交变磁场产热的辅助作用下,干细胞纳米探针可以显著抑制胃癌肿瘤组织的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间,这为iPSCs应用于胃癌的靶向诊断和治疗奠定了基础。


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