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《上海交通大学》 2013年
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猪链球菌噬菌体SMP末端酶大亚单位的生物学活性研究

毛紫微  
【摘要】:猪链球菌(Streptococcus suis, S. Suis)是常见的人畜共患病病原菌,其中猪链球菌2型是流行范围最广、致病力最强、危害最严重的猪链球菌,能导致猪脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎,甚至会致人死亡,严重威胁着公共卫生安全。预防、治疗猪链球菌病一般采用抗生素,但随着抗生素的滥用,菌株的耐药性不断增强,给该病的防控带来了困难,基于噬菌体的治疗策略再次成为研究热点。 末端酶(Terminase)是dsDNA病毒包装过程中的必要功能蛋白,其大亚单位在包装过程中往往行使全酶的作用,一般具有ATP酶活性和限制性内切酶活性。猪链球菌噬菌体SMP是一株猪链球菌2型的烈性噬菌体,但目前对该噬菌体的末端酶的编码基因和功能尚不清楚,本研究将通过大肠杆菌系统重组表达猪链球菌噬菌体末端酶大亚单位(TlsSMP),并研究TlsSMP融合蛋白的生物学活性。 本文利用SWISS-MODEL、NCBI CDD和PSIPRED等蛋白结构分析软件预测了噬菌体(SMP)末端酶大亚单位,结果显示,末端酶大亚单位具有一个结构域。基于蛋白三级结构的预测发现,末端酶大亚单位与G2P(噬菌体SPP1核酸酶功能域)同源性最高,达到30.5%,重叠区域位于240aa-412aa处,预测的末端酶大亚单位具有末端酶的结构特征。 为了制备末端酶大亚单位,本文应用大肠杆菌重组表达系统获得了具有生物学活性的TlsSMP。以噬菌体SMP基因组为模板,采用PCR方法扩增SMP末端酶大亚单位基因(TlsSMP),构建pEasy-E1-Tls重组质粒,转化至大肠杆菌中。通过IPTG(终浓度为0.4mmol/L)于16℃诱导表达15h,表达产物经过SDS-PAGE分析,确定其为53.26kD大小的TlsSMP融合蛋白。Western-blotting实验进一步表明,TlsSMP融合蛋白可被特异性血清识别,呈可溶性表达。 为了揭示重组TlsSMP的生物学功能,应用His-trap纯化柱纯化了融合蛋白,经浓缩后,浓度可达1-1.5mmol/L。基于磷酸检测试剂盒测定了TlsSMP融合蛋白水解ATP产生无机磷酸的水平,确认其具有ATP酶活性,进一步分析发现,TlsSMP在pH7、23℃和Mg2+存在的条件下,其ATP酶活性最强,其它金属离子如Ca2+、Mn2+和Co2+都对其有不同程度的抑制作用。除了ATP酶活作用外,末端酶大亚单位是否还具有限制性内切酶及DNA连接酶的作用,尚待进一步验证。 鉴于噬菌体末端酶在噬菌体等病毒包装中的重要作用,通过深入研究可为研制安全、高效的抗病毒药物、控制dsDNA病毒感染提供可能。
【学位授予单位】:上海交通大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S852.61

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【参考文献】
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