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《上海交通大学》 2013年
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采用SELEX技术筛选玉米赤霉烯酮单克隆抗体DNA适配子的初步研究

邹绮  
【摘要】:玉米赤霉烯酮(Zearalnenoe, ZEN)是由镰刀菌属真菌在生长过程中所产生的次生代谢产物,ZEN不仅可以直接污染多种谷物及饲料,还可以污染肉、蛋、奶等诸多动物源性食品。ZEN具有类雌激素活性,可对人和动物造成多种损害,包括生殖毒性、DNA损伤毒性、免疫抑制毒性等,严重威胁人和动物的健康,因此准确、及时监测食品和饲料中的ZEN已是全世界关注的问题。 SELEX技术即指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX),通过该技术可从体外人工合成的随机寡核苷酸文库中筛选出特定的核苷酸序列。由于寡核苷酸随机区域的碱基随机分布,可形成多种多样的二级空间结构,只要库容量足够大可与任何靶分子结合,因此从随机寡核苷酸库中可以筛选出针对各类靶分子的适配子(aptamer),即能与靶分子高特异性、高亲和力结合的小分子DNA或RNA片段。适配子具有精确识别靶物质、制备周期短、易体外合成等优点,可以替代相应的抗原或抗体。以玉米赤霉烯酮毒素的单克隆抗体为靶标,筛选具有抗原内影像关系的DNA适配子替代毒素本身,在建立检测方法时可不再使用毒素作为竞争抗原,从而研发出低毒、环保的检测试剂盒,确保检测毒素过程中对人类和环境的安全性。 研究通过体外人工合成一个全长71个碱基、中间随机序列为35nt的ssDNA文库,采用SELEX技术,以玉米赤霉烯酮单克隆抗体为靶分子,进行15轮筛选,并利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统测定每一轮富集文库与ZEN单抗的亲和力,将最后一轮富集文库进行克隆、测序,并运用DNAMAN软件分析适配子序列的一级结构和二级结构,测定克隆子与玉米赤霉烯酮单克隆抗体的亲和力,并进一步采用所筛选适配子替代毒素建立相应的检测方法。 试验结果表明,经过SELEX15轮的筛选,试验结果表明,每轮ssDNA富集文库与玉米赤霉烯酮单克隆抗体的亲和力呈上升趋势,结合显色后吸光度值从第1轮的0.125上升到第15轮的0.666,提高了5.328倍。随机挑选96个适配子进行克隆和序列分析,然后对序列正确的适配子进行二级结构分析和亲和性检测。获得63个适配子序列全长71bp,软件分析预测其二级结构主要为茎环状结构,说明茎环结构是适配子与靶分子结合的基础。其中46号克隆适配子亲和力相对较高,以此适配子建立酶联寡核苷酸试验(Enzyme-linked OligonucleatideAssay,ELOSA)检测方法。方阵滴定确定的最佳条件为:ZEN单抗最佳包被浓度为1μg/孔,适配子1:10稀释后浓度为80ng/ml,辣根过氧化物酶标的链霉亲和素1:300稀释后浓度为3μg/ml。用标准ZEN毒素溶液浓度分别为50.00、10.00、1.00、0.10、0.01、0.001、0.00ng/mL作为竞争抗原,每个浓度做3个平行孔,进行3次平行实验,获得竞争抑制曲线稳定。批内差异7.6%,批间差异9.3%,差异率均小于10%,表明该方法有较好的可靠性,玉米赤霉烯酮单克隆抗体特异性适配子的获得为今后研制相关的低毒、环保的免疫学检测试剂盒提供了前提条件。
【学位授予单位】:上海交通大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S435.131;TS207

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