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加压毛细管电色谱—质谱联用平台的搭建与应用及细胞代谢组学研究

余欣尉  
【摘要】:随着后基因时代的到来,代谢组学、蛋白组学、脂质组学等系统生物学研究已成为国际瞩目的研究热点,样品量的减少和样品复杂程度的增加,使得分析科学家们越来越重视分析技术的微型化及分离效率与灵敏度。 加压毛细管电色谱(pCEC)作为一种新兴的微流分析技术,具有电压和压力双重分离机理,以及高柱效、高选择性、高分辨率、快速分离等特点,在分析复杂生物样品中独具优势。质谱(MS)是一种被广泛用于物质结构分析与鉴定的通用型检测器,具有高灵敏度、高准确性等特点。电喷雾(ESI)接口等软电离技术解决了质谱与其他分离技术的在线联用,通过这种方式得到的集成系统具有高分辨力、高灵敏度,同时还能提供物质分子量和结构信息。 本课题将pCEC与MS在线联用,扩大pCEC的应用领域,为增加仪器产品的实用性和适用性提供有力的技术支持。研究中还提出了一种同时提取细胞极性与非极性代谢产物的方法,并采用液相色谱与质谱联用技术开展了细胞代谢组学研究。 本论文共分为五章,主要内容包括: 第一章介绍了选题的背景和意义,对加压毛细管电色谱、肺癌、代谢组学分别进行了综述。重点阐述了代谢组学研究在疾病分型和标志物研究,尤其是对肺癌早期筛查的重要意义。 第二章对pCEC-MS的接口进行设计并对其性能进了系统考察。对比了不同接口方式对分离和检测的影响,并首次实现了采用无补流型接口实现pCEC与MS联用。考察了流速、流动相中盐离子、毛细管两端电压对样品分离分析的影响,同时对联用系统的检测限和重现性进行考察。实验证明,所搭建的pCEC-MS联用系统操作简便,信号稳定,灵敏度高,样品检测限达ng/mL级。 第三章应用自行搭建的pCEC-MS系统进行代谢组学分析。采用柱上富集技术,有效提高了样品的信号响应强度。同时,对pCEC流动相中有机相组成、酸改性剂浓度、操作电压、洗脱梯度进行优化,并对所建立的pCEC-MS对尿的分析方法进行验证。将肺癌病人与正常人尿样分别进样分析,采用PCA和OPLS-DA模型对其进行统计分析,得到候选差异物49个。与正常人对照组相比,肺癌病人在肉毒碱、尿酸和氨基酸代谢通路上发生不同程度的紊乱。 第四章研究了基于高效液相色谱(HPLC)和质谱联用技术的肺癌细胞代谢组学分析。提出了一种同时提取细胞极性与非极性代谢产物的方法,并采用HPLC-MS技术对7种人肺癌细胞和人正常胚肺成纤维细胞进行分析,通过多元统计分析手段获得和鉴定出10种极性代谢差异物与21种非极性代谢差异物。与正常细胞相比,肺癌细胞在蛋白质代谢、脂肪酸代谢、磷脂代谢发生不同程度的紊乱。 第五章对全文进行总结与展望。所搭建的pCEC-MS联用平台能很好的完成对复杂生物样品体系的分离分析,适合于代谢组学的研究。研究中所建立的细胞代谢组学研究方法能与传统代谢组学研究相互佐证与补充,为研究癌症疾病机制,筛查或治疗提供了一种新的有效平台。


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