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海绵共生Bacillus atrophaeus C89的Bacillamide C生物合成相关酶的异源表达

朱春苗  
【摘要】:海绵共生微生物是活性天然产物的重要来源。海绵共生萎缩芽孢杆菌C89产bacillamide C,bacillamides类似物对多种肿瘤细胞具有细胞毒活性,同时,bacillamides家族具有抗藻活性,是潜在的天然杀藻剂。bacillamide C推测由非核糖体肽合成酶(NRPS)途径合成。其生物合成需要4个酶的参与:NRPS、上游氧化酶(Oxidase)、下游氨基酸脱羧酶(Decarboxylase,AADC)及Sfp型磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)。先期体外生化实验证明AADC能催化L-色氨酸形成色胺。本研究目的在于通过异源表达,在体内研究NRPS、AADC及Sfp型PPTase的功能,为探索bacillamide C的生物合成途径及bacillamides的异源生产奠定基础。为找到bacillamide C生物合成中催化NRPS中PCP的Sfp型PPTase,我们找到了B.atrophaeus C89基因组中所有的PPTase基因,通过BLAST和氨基酸多序列比对,鉴定了Sfp型PPTase Bap。将bap基因在sfp基因突变株Bacillus subtilis 168中异源表达,重组菌合成了非核糖体肽类化合物Surfactin。本研究说明Bap激活了Surfactin合成酶NRPS中所有的PCP,验证了Bap激活NRPS中PCP的能力。为研究bacillamide C的生物合成,我们扩增了完整的nrps-aadc基因簇并将其整合到高效异源表达宿主变铅青链霉菌SBT18的基因组中。通过HPLC检测到重组菌的发酵产物中产生了对照菌中没有的次级代谢产物,LC-MS和NMR鉴定该化合物为N-乙酰基色胺。推测AADC首先将L-色氨酸脱羧形成色胺,色胺再在宿主中某种N-乙酰基转移酶的催化作用下,形成N-乙酰基色胺。说明重组AADC能够催化色氨酸形成色胺。由于在链霉菌异源表达重组菌中没有检测到NRPS相关产物,因此为继续研究NRPS的功能,我们将nrps基因连接到p ET-28a上构建了重组质粒p ET28N,并将其与含有广谱底物选择性的PPTase基因sfp的质粒psv20共转化至Escherichia coli BL21(DE3)中。SDS-PAGE结果显示,NRPS在E.coli宿主中形成了可溶性蛋白。为进一步在大肠杆菌中共表达nrps和aadc基因以揭示bacillamide C生物合成途径奠定了基础。


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