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过表达Prox1诱导人脂肪干细胞向淋巴内皮分化的研究

邓景成  
【摘要】:目的:转录因子Prox1是维持淋巴管内皮细胞(LECs)迁移、增殖及淋巴脉管系统分化和成熟的决定性因子。具有LECs特异性表型的细胞植入淋巴回流阻塞区后可以主动参与急性损伤淋巴管的修复。本次研究主要探讨过表达Prox1基因诱导人脂肪来源干细胞(ADSCs)向LECs分化的作用,并观察分化后细胞的功能。方法:体外分离培养并鉴定人ADSCs。构建携带Prox1基因的慢病毒载体,并转染ADSCs使其过表达Prox1。CCK8检测及台盼蓝染色评价转染后的细胞增殖能力及细胞活力,流式细胞学分析观察转染前后细胞表面标志物的表达情况,RT-PCR检测转染后LECs特异性标志物Podoplanin、LYVE1、VEGFR3 及Prox1等因子的基因表达,Western blot及免疫荧光染色检测转染后上述因子在蛋白水平的表达,成血管试验用作转染后细胞的功能学评价。结果:台盼蓝染色及CCK8检测结果表明慢病毒转染ADSCs使其过表达Prox1后,细胞活力及增殖能力未受到影响(P0.05)。转染后第14天,细胞形态逐渐由长梭形转变为多边形的铺路石样外观。流式细胞学分析显示转染前ADSCs高表达间充质干细胞特异性表面标志物CD29、CD44与CD90,不表达内皮细胞(ECs)特异性表面标志物CD31及LECs特异性表面标志物Podoplanin与VEGFR3,而使用Prox1慢病毒转染ADSCs后14天及28天时,CD29、CD44与CD90表达显著性下调(P0.01),同时CD31、Podoplanin与VEGFR3表达显著性上调(P0.01)。RT-PCR结果显示转染后第7、14、21及28天时,诱导分化的细胞中Podoplanin、LYVE1与VEGFR3的mRNA水平显著性提高(P0.05)。转染后第14天时,Western blot检测到这些因子在蛋白水平呈现高表达。同时,免疫荧光染色观察到诱导后的细胞高表达Podoplanin,LYVE1及ECs特异性标志物VWF与CD144。成管实验发现诱导后的细胞可在Matrigel中形成管腔样结构。结论:过表达Prox1基因能诱导ADSCs向LECs方向分化,此研究结果为淋巴水肿患者的治疗提供了新思路。


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