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《上海交通大学》 2019年
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基于HPLC的燕窝与食品中唾液酸的含量测定及比较

伍晓燕  
【摘要】:唾液酸是糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要成分,在自然界广泛分布,包括人体的脑部、神经组织、血液以及乳液。唾液酸具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生物学活性,还可作用于神经系统,其在疾病的诊断与治疗、药物前体的合成、保健品的开发以及食品营养等方面有着十分广阔的应用前景。燕窝、牛奶、奶粉和鸡蛋等是唾液酸的主要食源性来源,由于燕窝和食品的基质复杂,因而对其中的唾液酸进行含量检测较为困难。本课题通过对近几年N-乙酰神经氨酸(NeuAc)即唾液酸的研究进展进行分析,确定了唾液酸含量的检测方法,优化唾液酸提取的条件,对燕窝与食品(禽蛋和乳品)中唾液酸的含量进行检测并比较,并确定了唾液酸衍生反应产物的结构,为鉴别燕窝质量、判断食品(禽蛋和乳品)的营养价值提供了实验依据,同时还为从天然产物及食品中提取和检测唾液酸提供了方法参考。第一章对唾液酸在燕窝及食品(禽蛋和乳品)中的分布、生物活性与体内代谢、唾液酸的理化性质。以及唾液酸在炎症、病毒、肿瘤和脑神经等生理疾病与临床用途相关方面的作用进行综述。通过对比国内外文献,总结了唾液酸的提取制备方法,可以分为四种:天然产物提取、微生物发酵、化学合成以及酶促合成。粗品唾液酸还需经过纯化分离,可以使用离子交换、超滤膜过滤、凝胶层析和溶析结晶等方法进行纯化。查阅国内近15年内关于测定燕窝中唾液酸方法的文献,对其中的检测方法如分光光度法、傅里叶红外光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法以及酶联免疫分析ELISA法等的优势与缺点进行对比和分析。与燕窝中唾液酸检测方法的报道相比,关于食品(如:禽蛋和乳品)中唾液酸的检测方法的报道并不多,主要为分光光度法和高效液相色谱法。本论文对这两种方法的优势与劣势进行比较和分析。第二章研究了唾液酸含量测定的方法。我们采用了柱前衍生-高效液相色谱法,即通过酸水解将样品中的唾液酸游离出来,然后与邻苯二胺盐酸盐反应生成唾液酸衍生物。高效液相色谱条件为:ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈:水=10:90,流速1.0mL/min,检测波长230 nm,进样体积10μL。实验过程中对燕窝样品中唾液酸的水解温度与时间、柱前衍生化反应的温度与时间等条件对唾液酸检测的影响进行探索,对高效液色谱流动相配比以及检测波长条件进行优化,经过方法学验证,确定最佳的检测方法。使用该方法我们测定了两种不同产地的燕窝、燕窝的伪品原料及掺假原料(猪皮、银耳)中唾液酸的含量,结果显示不同产地的燕窝中唾液酸的质量百分数差别不大,而猪皮与银耳之类伪燕窝样品中则无唾液酸特征峰。第三章节研究了唾液酸食源性来源之一禽蛋中唾液酸含量的分布。以鸡蛋、鸭蛋、乌骨鸡蛋、鹌鹑蛋以及鸽蛋五种不同品种的禽蛋为检测样本,与邻苯二胺盐酸盐进行柱前衍生反应,生成唾液酸衍生物,并利用HPLC检测其中唾液酸的百分含量。在柱前衍生反应时,由于蛋类样品所获得的待测溶液为乳浊液,我们对其过滤提取方法进行了探索,分别以定性滤纸抽滤、离心沉淀以及微孔滤膜过滤三种不同的方式对唾液酸衍生后的乳浊液进行过滤提取,在保证样品中唾液酸损失最少的条件下,确定进样前微孔径过滤膜过滤为最佳过滤提取方案。通过检测我们发现鸡蛋、鸭蛋、乌骨鸡蛋、鹌鹑蛋以及鸽蛋五种不同种类的禽蛋中,以鸽蛋样品中唾液酸的含量最高。五种不同种类的禽蛋中唾液酸含量与燕窝比较有较大差距。第四章节研究了另一种唾液酸食源性来源乳品中唾液酸含量的分布,选择了羊奶粉、婴儿奶粉、中老年高钙奶粉、成人全脂奶粉、脱脂牛奶以及全脂牛奶六种不同种类的乳品作为检测样本,测定其中唾液酸的含量。乳品样品中除了唾液酸还含有一定量的脂肪,直接进样会对唾液酸衍生物的检测造成影响。通过HPLC分离验证了目前的衍生化、提取、分离和检测方法能够准确检测乳品中唾液酸的含量。结果显示六种不同种类的乳品中唾液酸的含量有一定的区别,以羊奶粉中唾液酸的含量最高。六种不同种类的乳品中唾液酸含量与燕窝比较有较大差距,但与禽蛋中唾液酸含量相类似。第五章节简述了利用飞行时间质谱学的方法推测唾液酸柱前衍生反应产物的结构,解释了唾液酸样品柱前衍生化反应的过程,进一步提高了实验结果的准确性。第六章对唾液酸开发前景和研究趋势进行总结与展望。
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