产紫杉醇内生真菌的遗传转化及紫杉醇合成途径相关基因的克隆

【摘要】： 紫杉醇是高效、低毒、广谱的天然抗癌药物,目前临床和科研所需的紫杉醇主要是从红豆杉中直接提取或是经化学半合成法合成。但是,天然红豆杉资源的稀缺、生长缓慢以及紫杉醇含量又极低制约了紫杉醇的市场供应。因此,采用各种手段积极寻求紫杉醇新药源生产途径,扩大紫杉醇供应能力,已成为紫杉醇产业发展的重点研究方向之一。以真菌取代红豆杉作为紫杉醇的药源,通过微生物发酵工程生产紫杉醇,也许是解决药源短缺的有效途径之一。 为解决紫杉醇药源短缺问题,本研究从两个方面开展研究:一是从我国珍稀药用植物红豆杉树皮中分离产紫杉醇的内生真菌,同时克隆内生真菌中紫杉醇合成途径相关基因并建立内生真菌的遗传转化系统,并将紫杉醇合成途径关键酶基因构建到真菌表达载体上,为利用基因工程手段提高内生真菌中紫杉醇含量、最终实现利用真菌发酵方法商业化生产紫杉醇打下基础。二是从产紫杉醇植物欧洲榛子中克隆紫杉醇合成途径相关基因,为今后利用基因工程手段将紫杉醇生物合成途径关键酶基因导入山榛中来提高紫杉醇含量提供候选基因。本研究得到如下结果: 1)利用表面消毒除菌方法从野生南方红豆杉树皮中分离到120个不同的内生真菌菌株,经三周摇床培养发酵、提取、浓缩后经HPLC、LC-MS对120个不同的内生真菌发酵液提取物进行检测,在编号为EFY-110的内生真菌发酵液提取物中检测到了紫杉醇及其重要前体巴卡亭III。抗癌细胞活性实验结果表明,该菌株发酵液提取物能显著抑制或杀死肝癌细胞系BEL7402。根据生理特性和形态学特点,该菌株被鉴定为双孢束梗孢菌(Didymostilbe sp.),将其命名为DF110,该菌株不同于国内外已报道的产紫杉醇内生真菌。 2)以本研究组以前分离到的产紫杉醇BT2菌株为研究材料,采用RACE技术,首次成功克隆了3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(BT2HMGR)的全长cDNA序列及其基因组序列,该基因全长3926 bp,含有一个3522 bp的开放阅读框,编码一个具有1173个氨基酸残基的蛋白,序列比对结果表明,BT2HMGR基因含有四个外显子和三个内含子;BLASTP分析显示,该基因编码的氨基酸与其它真菌的HMGR有较高相似性。Southern杂交表明,该基因在BT2基因组中以单拷贝形式存在。RT-PCR分析发现,BT2HMGR基因的表达受甲基茉莉酸(MeJA)诱导。 3)成功建立了利用限制酶介导整合(REMI)技术的产紫杉醇内生真菌BT2的遗传转化体系及检测方法,获得了42个稳定转化子,PCR和Southern blot分析证明外源潮霉素基因已被成功整合到BT2基因组中,转化频率大约是5-6个转化子/微克质粒DNA。该系统的建立为今后利用紫杉醇合成途径关键基因转化产紫杉醇内生真菌、提高其中的紫杉醇含量打下了基础。 4)首次将紫杉醇合成途径上的四个关键酶基因TS,DBAT,BAPT和DBTNBT分别构建到真菌表达载体pV2上,为转化产紫杉醇内生真菌提供了备选载体。 5)本研究采用RACE技术首次从产紫杉醇植物欧洲榛子Gasaway中克隆了紫杉醇合成途径重要基因HMGR(CgHMGR)全长cDNA序列。蛋白质序列多重比对发现,CgHMGR与其它植物的HMGR具有很高同源性。Southern blot分析表明,CgHMGR属于一个多基因家族。RT-PCR分析发现,CgHMGR在榛子根、茎和叶中均表达,而在根中表达量最高。CgHMGR的表达受甲基茉莉酸诱导。功能测验实验表明,CgHMGR能加速大肠杆菌中胡萝卜素的积累,从而证明了CgHMGR编码一个功能蛋白。 6)本研究采用RACE技术首次从欧洲榛子Gasaway中分离到了IPI基因(CgIPI基因)全长cDNA序列。蛋白质序列多重比对结果表明, CgIPI蛋白和其它植物来源的IPI具有较高同源性。IPI系统发生树分析表明,CgIPI与其它植物来源的IPI具有共同的祖先。Southern blot分析表明,CgIPI基因属于一个多基因家族。组织特异性表达分析显示,CgIPI基因在榛子根中的表达量高于茎和叶中。功能测验实验表明,CgIPI基因能加速大肠杆菌中胡萝卜素的积累,从而证明了CgIPI编码一个功能蛋白。 7)本研究采用RACE技术首次克隆出了山榛的GGPPS基因(CgGGPPS基因)全长cDNA序列。蛋白质序列多重比对结果表明,CgGGPPS蛋白和其它植物来源的GGPPS蛋白具有较高同源性,CgGGPPS含有典型的异戊烯转移酶7个氨基酸保守区(I-VII)。CgGGPPS系统发生树分析表明,CgGGPPS与H.brasiliensis中该蛋白有更近的亲缘关系。Southern blot分析表明,CgGGPPS基因属于一个多基因家族。RT-PCR分析表明,CgGGPPS基因在叶中的表达量高于根和茎中,CgGGPPS的表达受甲基茉莉酸诱导。 本研究论文报道了从我国珍稀药用植物南方红豆杉中分离到一株产紫杉醇及其重要前体巴卡亭III的内生真菌DF110(Didymostilbe sp.)、克隆了产紫杉醇内生真菌BT2中的紫杉醇合成途径相关基因、建立了基于REMI技术的内生真菌遗传转化系统并分别构建了携带紫杉醇合成途径四个关键酶基因的真菌表达载体。同时,从产紫杉醇植物欧洲榛子Gasaway中克隆了紫杉醇合成途径三个重要基因(CgHMGR, CgIPI和CgGGPPS),分析了这些基因在山榛基因组中的拷贝情况及组织表达特异性,以及HMGR和GGPPS受甲基茉莉酸诱导的表达特征,并在大肠杆菌中验证了CgHMGR和CgIPI基因的功能。本研究为今后利用基因工程手段提高产紫杉醇内生真菌和山榛中紫杉醇的含量打下了基础,并对在在分子水平上深入了解产紫杉醇内生真菌和山榛中紫杉醇合成及其代谢调控机制具有重要意义。